本文關鍵詞：副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素細胞毒性機制研究

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【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是引起副豬嗜血桿菌病的病原,該病主要表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎及腦膜炎。細胞致死膨脹毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)是H.parasuis的重要毒力因子,由CdtA、CdtB和CdtC 3個亞基組成。為研究副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素(HpCDT)對宿主細胞的毒性作用,本研究以豬肺泡巨噬細胞(PAM)和PK-15細胞為模型,運用流式細胞術、激光共聚焦、免疫印跡、熒光定量PCR等方法進行毒素與細胞的互作研究。通過Predsi、Signal-Blast和Signal-3L軟件預測CdtA,CdtB和CdtC的信號肽,結果顯示其信號肽分別為N端1-19aa、1-21aa和1-19aa。去掉信號肽后成功地以可溶形式表達了3種重組蛋白。純化的CdtB在體外能夠剪切環(huán)狀或線性DNA,表明其具有DNase活性;在體內純化的CdtB能夠誘導PK-15細胞產生γ-H2A.X,說明其具有DNase活性,并引起了DNA雙鏈斷裂。經流式細胞儀分析重組蛋白處理的細胞周期和凋亡情況,結果表明單獨的CdtB能夠引起PAM和PK-15細胞G2/M期阻滯和細胞凋亡,而在CdtA或/和CdtC的幫助下能夠更顯著地增強這種作用。進一步研究結果表明CDT全毒素能夠引起最顯著的細胞膨脹、細胞周期阻滯和細胞凋亡。Pifithrin-α和CDT共同處理PK-15細胞能夠明顯地抑制其細胞凋亡,說明CDT誘導的凋亡是p53依賴的。通過基因表達譜芯片分析各亞基的細胞毒性,顯示各亞基作用于細胞均有大量的基因表達發(fā)生變化�？傊�,本研究成功地以可溶形式純化了去掉信號肽的HpCDT的3個亞基,CdtB在體內體外均具有DNase活性,單獨的CdtB能夠引起細胞周期阻滯和凋亡,CdtA和CdtC能夠增強其細胞毒性,3個亞基共同作用能夠發(fā)揮最大毒性,CDT介導的凋亡是p53依賴的。
【關鍵詞】：副豬嗜血桿菌 細胞致死膨脹毒素 細胞周期 細胞凋亡 p53
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 副豬嗜血桿菌簡介11-15
• 1.1.1 病原學11
• 1.1.2 致病機理11-13
• 1.1.3 流行病學13
• 1.1.4 臨床癥狀和病理變化13-14
• 1.1.5 診斷14
• 1.1.6 預防14-15
• 1.2 CDT的研究進展15-20
• 1.2.1 CDT簡介15
• 1.2.2 CDT的結構及酶活性15-16
• 1.2.3 CDT的內化16
• 1.2.4 CDT細胞毒性機制的研究16-18
• 1.2.5 CDT引起的炎癥反應18-20
• 1.3 研究目的和意義20-21
• 第二章 副豬嗜血桿菌細胞致死膨脹毒素的細胞毒性機制21-40
• 2.1 材料與方法21-26
• 2.1.1 菌株和細胞21
• 2.1.2 主要儀器與試劑21
• 2.1.3 信號肽預測21-22
• 2.1.4 cdtA，cdtB和cdtC基因擴增22
• 2.1.5 重組質粒的構建與鑒定22
• 2.1.6 CdtA，，CdtB和CdtC原核表達、純化及鑒定22-23
• 2.1.7 DNase活性試驗23
• 2.1.8 γ-H2A.X間接流式分析23
• 2.1.9 細胞周期分析23
• 2.1.10 細胞凋亡分析23-24
• 2.1.11 激光共聚焦試驗24
• 2.1.12 Western blot24
• 2.1.13 熒光定量RT-PCR24-25
• 2.1.14 細胞處理及表達譜芯片分析25
• 2.1.15 差異基因表達的驗證25
• 2.1.16 數據分析25-26
• 2.2 結果26-38
• 2.2.1 信號肽預測26
• 2.2.2 cdtA，cdtB和cdtC基因擴增26-27
• 2.2.3 重組質粒的構建與鑒定27-28
• 2.2.4 CdtA，CdtB和CdtC原核表達、純化及鑒定28-29
• 2.2.5 DNase活性試驗29
• 2.2.6 CdtB引起細胞DNA雙鏈斷裂29-30
• 2.2.7 CDT誘導PAM和PK-15細胞周期阻滯30-33
• 2.2.8 CDT誘導的細胞凋亡33-34
• 2.2.9 CDT誘導p53依賴的細胞凋亡34-35
• 2.2.10 CDT各亞基作用細胞基因表達譜變化35-36
• 2.2.11 CDT各亞基作用細胞基因的變化36-38
• 2.3 討論38-40
• 第三章 全文結論40-41
• 參考文獻41-51
• 致謝51-52
• 作者簡介52

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