本文關(guān)鍵詞：基于DNA甲基化途徑葉酸對阿爾茨海默病模型作用機(jī)制的研究

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【摘要】：目的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理特征是細(xì)胞外淀粉樣蛋白(amyloid-βpeptide,Aβ)沉積,以及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)高磷酸化tau蛋白形成神經(jīng)纖維節(jié)纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)。AD的發(fā)生與多種營養(yǎng)素缺乏有關(guān),葉酸作為一碳單位供體參與一碳單位代謝,進(jìn)而參與體內(nèi)多種甲基化過程,包括DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化等。而一碳單位代謝異�？稍黾硬溉閯游锬X海馬區(qū)Aβ沉積,改變tau蛋白磷酸化水平。異常的DNA和蛋白質(zhì)甲基化可能是與AD病理機(jī)制相關(guān)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。該研究將探討葉酸通過DNA甲基化途徑對AD模型的作用機(jī)制,為葉酸防治AD提供科學(xué)依據(jù)和新的思路。方法采用三種AD細(xì)胞模型和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型研究葉酸對AD模型的作用機(jī)制。三種細(xì)胞模型分別為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP695的小鼠N2a細(xì)胞,Aβ低聚物誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型和磷酸酯酶抑制劑誘導(dǎo)損傷的人神經(jīng)母細(xì)胞(SH-SY5Y)瘤模型。分別模擬基因異常以及AD細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病理機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,對體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以驗(yàn)證。體外實(shí)驗(yàn)采用不同濃度葉酸(2.8-40μmol/L)孵育N2a-APP細(xì)胞96 h,并于細(xì)胞中添加甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)阻斷劑,檢測各組細(xì)胞甲基化潛能,DNMT活性,APP,PS1和Aβ的表達(dá)。不同濃度葉酸干預(yù)由Aβ低聚物造成細(xì)胞AD樣損傷的原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞和小鼠神經(jīng)元HT-22細(xì)胞96 h,檢測各組細(xì)胞DNMT活性,APP和PS1的表達(dá),以及細(xì)胞活力。不同濃度葉酸(0-40μmol/L)作用于由磷酸酶抑制劑(okadaic acid,OA)(10 nmol/L)孵育的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)96 h。檢測葉酸對tau蛋白磷酸化的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用七月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型檢測葉酸干預(yù)后動物腦內(nèi)Aβ的表達(dá)狀況。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠飼喂葉酸缺乏飼料或普通飼料,并灌胃葉酸和/或S-腺苷蛋氨酸(s-adenosylmethionine,SAM),采用免疫組化、western blot和RT-pcr法檢測APP,PS1和Aβ的表達(dá);采用高效液相色譜法檢測肝臟組著和腦組織中SAM和SAH的表達(dá);采用焦磷酸測序法檢測APP、PS1基因的甲基化水平。結(jié)果葉酸干預(yù)N2a-APP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,葉酸提高APP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞甲基化潛能,DNMTs基因和蛋白表達(dá)水平及其活性,提高APP和PS1甲基化水平。進(jìn)而,葉酸降低APP基因表達(dá),PS1基因和蛋白表達(dá),降低Aβ蛋白表達(dá),同時抑制DNMT活性后Aβ蛋白表達(dá)增加。葉酸干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Aβ低聚物降低神經(jīng)元細(xì)胞DNMT活性,增加PS1和APP表達(dá),并降低細(xì)胞活力。補(bǔ)充葉酸后神經(jīng)元細(xì)胞甲基化潛能和DNMT活性提高,PS1和APP基因啟動子區(qū)甲基化水平增高,降低PS1和APP表達(dá),并提高細(xì)胞活力。而OA孵育的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白Ser396位點(diǎn)高磷酸化,葉酸添加可抑制tau蛋白磷酸化,最大抑制劑量為40μmol/L。葉酸通過抑制去甲基化PP2A降低tau蛋白磷酸化。高葉酸(20和40μmol/L)可增加細(xì)胞活力和細(xì)胞甲基化潛能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因小鼠灌胃葉酸60天后,血清葉酸水平明顯升高,但是灌胃SAM不能明顯提高血清葉酸水平。葉酸缺乏可降低動物肝臟中SAM濃度,但對SAH的影響不明顯。灌胃葉酸可提高小鼠腦內(nèi)DNMT活性,改變APP,PS1基因啟動子區(qū)甲基化水平。葉酸缺乏可增加轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)APP,PS1和Aβ表達(dá)水平,灌胃葉酸可降低上述蛋白表達(dá)水平。結(jié)論體內(nèi)、體外研究結(jié)果顯示,葉酸對AD的作用機(jī)制,一方面可通過提高細(xì)胞甲基化潛能和調(diào)節(jié)DNMT酶活性,使APP和PS1基因甲基化并靜默,進(jìn)而減少Aβ蛋白蓄積,抑制Aβ低聚物對神經(jīng)元細(xì)胞的毒性;另一方面葉酸可改變PP2A甲基化,進(jìn)而影響tau蛋白磷酸化,從而抑制tau蛋白的異常磷酸化。
【關(guān)鍵詞】：葉酸 阿爾茨海默病 甲基化 β-淀粉樣蛋白 磷酸化tau蛋白
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語/符號說明11-13
• 前言13-20
• 研究現(xiàn)狀、成果13-16
• 研究目的、方法16-20
• 一、葉酸對APP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Aβ形成的影響及機(jī)制研究20-54
• 1.1 對象和方法20-40
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 1.1.2 方法24-40
• 1.1.3 統(tǒng)計(jì)分析40
• 1.2 結(jié)果40-49
• 1.2.1 葉酸對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞Aβ 淀粉樣蛋白產(chǎn)生的影響40-42
• 1.2.2 葉酸對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞APP，PS1基因甲基化的影響42-45
• 1.2.3 葉酸對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞APP，PS1基因表達(dá)的影響45-46
• 1.2.4 葉酸對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞DNMTs基因表達(dá)及其活性的影響46-49
• 1.2.5 葉酸對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞DNA甲基化潛能的影響49
• 1.3 討論49-53
• 1.3.1 葉酸劑量設(shè)定的依據(jù)49-50
• 1.3.2 葉酸調(diào)節(jié)細(xì)胞甲基化潛能和改變細(xì)胞DNMT酶活性50-52
• 1.3.3 含有葉酸的復(fù)合營養(yǎng)制劑在AD病理過程中的作用52-53
• 1.4 小結(jié)53-54
• 二、葉酸對外源性Aβ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究54-74
• 2.1 對象和方法54-59
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 2.1.2 方法55-59
• 2.1.3 統(tǒng)計(jì)分析59
• 2.2 結(jié)果59-70
• 2.2.1 原代細(xì)胞鑒定，細(xì)胞活力和DNMTs活力59-62
• 2.2.2 葉酸提高外源性Aβ低聚物誘導(dǎo)AD樣損傷神經(jīng)元細(xì)胞APP，PS1基因甲基化水平62-65
• 2.2.3 葉酸降低外源性Aβ低聚物誘導(dǎo)AD樣損傷神經(jīng)元細(xì)胞APP，PS1基因表達(dá)65-67
• 2.2.4 葉酸提高外源性 Aβ低聚物誘導(dǎo) AD 樣損傷神經(jīng)元細(xì)胞 DNMTs 基因表達(dá)67-70
• 2.2.5 葉酸提高外源性Aβ低聚物誘導(dǎo)AD樣損傷神經(jīng)元細(xì)胞甲基化潛能70
• 2.3 討論70-73
• 2.3.1 外源性Aβ低聚物可誘發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生類AD樣損傷70-73
• 2.3.2 葉酸通過改變基因甲基化水平改善Aβ低聚物引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性73
• 2.4 小結(jié)73-74
• 三、葉酸對SH-SY5Y細(xì)胞高磷酸化tau蛋白形成的影響及機(jī)制研究74-87
• 3.1 對象和方法74-76
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料74
• 3.1.2 方法74-76
• 3.1.3 統(tǒng)計(jì)分析76
• 3.2 結(jié)果76-83
• 3.2.1 葉酸對高磷酸化tau蛋白的作用76-77
• 3.2.2 葉酸對PP2Ac蛋白表達(dá)及其甲基化的作用77-79
• 3.2.3 葉酸對SH-SY5Y細(xì)胞甲基化潛能的作用79-80
• 3.2.4 葉酸對SH-SY5Y細(xì)胞活力的作用80
• 3.2.5 tau蛋白磷酸化，PP2a蛋白去甲基化，一碳單位代謝，SH-SY5Y細(xì)胞活力和葉酸的關(guān)系80-83
• 3.3 討論83-86
• 3.3.1 葉酸調(diào)節(jié)PP2A甲基化進(jìn)而改善tau蛋白高磷酸化83-84
• 3.3.2 PP2Ac啟動子區(qū)的甲基化水平調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化84-85
• 3.3.3 葉酸調(diào)節(jié)PP2Ac啟動子區(qū)甲基化85-86
• 3.4 小結(jié)86-87
• 四、葉酸對雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ形成的影響及機(jī)制研究87-105
• 4.1 對象和方法87-91
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料87-88
• 4.1.2 方法88-91
• 4.1.3 統(tǒng)計(jì)分析91
• 4.2 結(jié)果91-103
• 4.2.1 動物體重和血清葉酸水平91-92
• 4.2.2 腦組織中APP，PS1基因及蛋白表達(dá)水平92-97
• 4.2.3 腦組織中Aβ表達(dá)水平97-99
• 4.2.4 腦內(nèi)APP，PS1基因啟動子區(qū)甲基化水平99-100
• 4.2.5 腦內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶活性100-101
• 4.2.6 肝臟和腦組織中SAM，，SAH表達(dá)水平101-103
• 4.3 討論103-104
• 4.3.1 葉酸通過調(diào)節(jié)APP，PS1基因甲基化降低轉(zhuǎn)基因動物腦內(nèi)Aβ水平103-104
• 4.3.2 葉酸降低轉(zhuǎn)基因動物腦內(nèi)Aβ水平的其他可能機(jī)制104
• 4.4 小結(jié)104-105
• 全文結(jié)論105-107
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)107-108
• 參考文獻(xiàn)108-118
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明118-120
• 綜述 阿爾茨海默病相關(guān)膳食因素研究120-141
• 綜述參考文獻(xiàn)127-141
• 致謝141

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：991014