本文關(guān)鍵詞：缺血缺氧性視神經(jīng)視網(wǎng)膜損傷的分子機制研究

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【摘要】：第一部分Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的作用1研究背景眼部缺血缺氧后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)生病理改變,可引起視神經(jīng)不可逆的損傷,導(dǎo)致視力損失甚至失明。目前研究發(fā)現(xiàn),眼部缺血缺氧損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜動靜脈阻塞、未成熟的視網(wǎng)膜病變、糖尿病性的視網(wǎng)膜病變、青光眼等視網(wǎng)膜血管阻塞所致的缺血性疾病中,表現(xiàn)為組織細胞缺血及缺氧損傷后,細胞正常結(jié)構(gòu)消失、功能破壞等。因此,保護視神經(jīng)、減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞缺血缺氧后損傷等研究具有重要的意義和作用。前期文獻報道提示,Homer1a作為一種重要的突觸后致密物質(zhì),在創(chuàng)傷性腦損傷中具有重要作用,可通過調(diào)節(jié)Erk信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。也有研究發(fā)現(xiàn)Homer1和眼部疾病密切相關(guān),但在眼部缺血缺氧損傷后Homer1a的改變與作用尚不明確,仍需進一步研究。本研究的目的是:(1)明確眼部缺血缺氧后Homer1a的表達變化;(2)探討在眼部缺血缺氧后Homer1a對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用及其機制。2方法(1)細胞模型:原代培養(yǎng)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,采用氧糖剝奪模型;(2)動物模型:生理鹽水誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型;(3)蛋白表達:采用Western blot檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞或視網(wǎng)膜中Homer1a、Erk、磷酸化Erk(p-Erk)、剪切的Caspase3(cleaved-Caspase3)、Caspase3等蛋白在缺血缺氧后的表達變化;(4)細胞損傷:TUNEL染色及Caspase3剪切水平檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡情況,β-III-微管蛋白染色檢測視網(wǎng)膜缺血缺氧后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活情況;(5)藥物干預(yù):應(yīng)用Erk抑制劑(PD98059)抑制Erk激活;(6)基因干涉/過表達:采用慢病毒介導(dǎo)的基因干涉/過表達手段調(diào)節(jié)Homer1a表達;(7)基因敲除動物:采用Homer1a基因敲除動物驗證Homer1a神經(jīng)保護作用。3結(jié)果和結(jié)論本實驗分別使用細胞及動物缺血缺氧模型,通過Western blot、基因干涉/過表達、TUNEL染色、基因敲除等方法,研究Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的表達改變、作用及其機制。我們的研究發(fā)現(xiàn),體外視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧糖剝奪或體內(nèi)眼部缺血缺氧損傷后,Homer1a及p-Erk表達水平均顯著升高。在體外實驗中,上調(diào)Homer1a后,p-Erk表達水平顯著下降,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡率明顯降低;而下調(diào)Homer1a蛋白,p-Erk表達水平升高,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率也增高。此外,抑制Erk活性,Home1a表達明顯增加,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率明顯下降。以上實驗表明,氧糖剝奪損傷后,Homer1a可保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞;在相同損傷條件下,p-Erk表達水平和細胞凋亡率有相關(guān)關(guān)系,高表達p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率升高,而低表達p-Erk視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率降低;Homer1a與Erk信號通路相互作用,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。進一步的體內(nèi)實驗表明:小鼠眼部缺血缺氧造模后,Homer1a基因敲除小鼠(KO,Homer1a-/-)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率及突起連接較野生型小鼠(WT,Homer1a+/+)顯著降低,進一步證實視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后Homer1a可能有神經(jīng)保護作用。綜上,在眼部缺血缺氧損傷中Homer1a可能通過調(diào)節(jié)Erk信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。第二部分NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用1研究背景眼部缺血缺氧可導(dǎo)致眼底部神經(jīng)組織不可逆損傷,該種損傷存在于多種眼部疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中。近期研究表明,眼部的缺血缺氧損傷最早發(fā)生在視乳頭區(qū),眾所周知,視乳頭區(qū)是視神經(jīng)出眼入顱的部位,該部位視神經(jīng)可直接和小膠質(zhì)細胞接觸,當小膠質(zhì)細胞受刺激被激活后,可迅速釋放炎性因子等,引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),最終引起細胞組織損傷。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn),在小鼠和人的視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體高表達。NLRP3炎性體作為Caspase1激活的平臺,在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用。但NLRP3炎性體激活并導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細胞損傷的具體機制尚不明確,仍需進一步研究。本研究的目的是:(1)明確NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的改變與作用;(2)探討NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷后的確切作用機制。2方法(1)動物模型:聚苯乙烯微球前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型;(2)免疫熒光染色:β-Ⅲ-微管蛋白標記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及Iba1染色標記小膠質(zhì)細胞;(3)分子表達:采用熒光實時定量的方法檢測動物視網(wǎng)膜乳頭區(qū)組織中炎性體相關(guān)蛋白在缺血缺氧后的表達變化。3結(jié)果和結(jié)論本實驗使用聚苯乙烯微球前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型,通過免疫熒光染色、熒光實時定量等方法,研究NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用及機制。本研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性體在正常人及小鼠視網(wǎng)膜乳頭區(qū)均高表達。小鼠眼部缺血缺氧損傷后,NLRP3敲除小鼠(KO,NLRP3-/-)及ASC敲除小鼠(KO,ASC-/-)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率及突起連接較野生型小鼠(C57/BL6J)顯著增加,證實視網(wǎng)膜缺血缺氧損傷后NLRP3炎性體可能在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷中起重要作用。進一步熒光實時定量方法發(fā)現(xiàn),眼部缺血缺氧損傷后,野生型小鼠(C57/BL6J)視網(wǎng)膜乳頭區(qū)NLRP3炎性體相關(guān)分子Caspase1、IL-1β和IL-18表達顯著升高。以上結(jié)果證明,NLRP3炎性體在小鼠眼部缺血缺氧損傷中,活化小鼠視乳頭區(qū)Caspase1、IL-1β和IL-18等炎性因子。此外,IL-1R敲除小鼠(KO,IL-1R-/-)及IL-18敲除小鼠(IL-18-/-)眼部缺血缺氧損傷后,較野生型小鼠(C57/BL6J),其視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率及突起連接明顯增加,提示IL-1β和IL-18等炎性因子可招募下游分子,引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷。以上結(jié)果證明,NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中可通過激活Caspase1活化并釋放IL-1β和IL-18,引發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷,破壞其突起連接,發(fā)揮神經(jīng)損傷作用。
【關(guān)鍵詞】：眼部缺血缺氧 視乳頭 Homer蛋白 Erk信號通路 NLRP3炎性體
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774.1
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-17
• 文獻回顧17-34
• 第一部分 Homer1a在眼部缺血缺氧損傷中的作用34-55
• 1 材料34-39
• 1.1 實驗動物34-35
• 1.2 慢病毒載體構(gòu)建及包裝35
• 1.3 實驗試劑35-37
• 1.4 實驗儀器37-38
• 1.5 試劑38-39
• 2 方法39-43
• 2.1 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞原代培養(yǎng)及氧糖剝奪模型39-40
• 2.2 慢病毒視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞轉(zhuǎn)染40
• 2.3 蛋白質(zhì)提取及定量40-41
• 2.4 Western blot檢測41
• 2.5 TUNEL染色41-42
• 2.6 前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血模型42
• 2.7 β-Ⅲ-微管蛋白染色標記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞42-43
• 2.8 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的量化觀察43
• 2.9 數(shù)據(jù)處理與分析43
• 3 結(jié)果43-52
• 3.1 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧糖剝奪缺氧損傷后Homer1a、p-Erk和cleaved-casapase3 改變43-47
• 3.2 小鼠眼部缺血缺氧損傷后視網(wǎng)膜Homer1a及p-Erk的變化47-48
• 3.3 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧糖剝奪缺氧損傷后抑制Erk激活對凋亡的影響48-49
• 3.4 Homer1a表達改變對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的影響49-51
• 3.5 Homer1a基因敲除小鼠眼部缺血缺氧損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞改變51-52
• 4 討論52-55
• 第二部分 NLRP3炎性體在眼部缺血缺氧損傷中的作用55-83
• 1 材料55-57
• 1.1 實驗動物55
• 1.2 實驗試劑55-56
• 1.3 實驗儀器56-57
• 2 方法57-66
• 2.1 聚苯乙烯微球前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型57
• 2.2 小鼠眼壓測量57-58
• 2.3 β-Ⅲ-微管蛋白標記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞58-59
• 2.4 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的量化觀察59
• 2.5 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突的量化觀察59
• 2.6 總RNA提取59-61
• 2.7 RNA質(zhì)量、濃度測定61-63
• 2.8 c DNA的合成63-64
• 2.9 熒光實時定量檢測表達64-66
• 2.10 視乳頭免疫組織熒光66
• 3 結(jié)果66-79
• 3.1 聚苯乙烯微球前房注射誘導(dǎo)小鼠眼部缺血缺氧模型66-69
• 3.2 NLRP3炎性體在C57/BL6J小鼠視乳頭中的表達69-70
• 3.3 小鼠高眼壓缺血缺氧損傷后NLRP3、ASC分子對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用70-74
• 3.4 小鼠高眼壓缺血缺氧損傷后IL-1β 和IL-18分子對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用74-77
• 3.5 高眼壓缺血缺氧損傷后小膠質(zhì)細胞在視乳頭區(qū)的遷徙作用77-79
• 4 討論79-83
• 小結(jié)83-85
• 參考文獻85-110
• 個人簡歷和研究成果110-112
• 致謝112

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本文編號：989215