本文關(guān)鍵詞：褪黑素保護鎘暴露所致肝毒性效應(yīng)的機制探討

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【摘要】：研究背景褪黑素是一種在哺乳動物和人體體內(nèi)主要由松果體分泌的吲哚胺類激素,其在人體內(nèi)有著促進睡眠、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等廣泛的生物學作用。重金屬元素鎘(Cadmium),由于其在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛的應(yīng)用及環(huán)境中的廣泛的存在,在職業(yè)作業(yè)環(huán)境中常能引起職業(yè)暴露,引起職業(yè)人群的健康危害;同時,因為其可以在食物鏈內(nèi)傳遞的特性,最后可以通過消化道或者呼吸道途徑富集于人體,導致非職業(yè)人群的健康危害。鎘離子在被機體攝入后,首先在血液中與白蛋白結(jié)合后,通過循環(huán)系統(tǒng)被運輸?shù)礁闻K中。經(jīng)過肝臟的解毒作用,鎘離子可以少部分通過與谷胱甘肽(GSH)結(jié)合,經(jīng)過膽汁排泄;但其大部分在肝臟內(nèi)誘導金屬硫蛋白(MT)生成,再與之相結(jié)合,透過腎小球基底膜,部分通過尿液排泄,更多的是蓄積在腎臟內(nèi),危害人體健康。因此肝臟是急性鎘暴露造成機體損傷的公認的主要靶器官之一,但是其損傷機制目前尚未完全明確。線粒體是鎘離子進入細胞后作用的主要靶器官之一,研究報道鎘離子可以造成線粒體腫脹、活性氧生成水平增加、線粒體DNA突變幾率增加和線粒體膜電位降低等損傷,最終會造成線粒體功能障礙。而已有許多報道稱線粒體功能障礙是許多疾病的重要病因,因為我們猜測在鎘急性暴露引起肝毒性中線粒體功能障礙同樣起了重要作用。線粒體生成水平是影響線粒體功能狀態(tài)的重要因素。PGC-1α(Peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1 alpha)是涉及到線粒體生成關(guān)鍵步驟中的重要因素,其上游信號分子SIRT1能夠通過調(diào)節(jié)PGC-1α的乙�；癄顟B(tài)及活性水平來調(diào)節(jié)其在細胞內(nèi)的功能狀態(tài),進一步影響線粒體生成及功能狀態(tài)。有報道稱褪黑素能夠保護鎘暴露所導致的肝毒性,除了作為抗氧化劑能夠直接清除自由基外,其是否涉及到其他機制尚不明確�；谝陨戏治�,本研究旨在以線粒體功能改變和線粒體生成為切入點,通過細胞水平的實驗,明確鎘暴露引起線粒體功能障礙和線粒體生成受損在鎘的肝毒性中的作用;通過明確褪黑素對鎘的肝毒性的保護作用及對SIRT1/PGC-1α信號通路和褪黑素受體1(Melatonin Receptor 1,MT1)的影響,揭示褪黑素對于鎘的肝毒性的保護機制。研究內(nèi)容①以Hep G2細胞為模型,通過建立含有不同濃度梯度的氯化鎘(Cd Cl2)的培養(yǎng)基,構(gòu)造鎘暴露損傷模型,以細胞活力評估鎘暴露對肝細胞的損傷作用;以活性氧生成和線粒體膜電位水平評估鎘暴露對線粒體功能狀態(tài)的影響;以線粒體dna拷貝數(shù)和線粒體質(zhì)量評估鎘暴露對線粒體生成的影響;②在上一步中建立的鎘暴露模型基礎(chǔ)上,加上褪黑素這種對線粒體功能有確切保護效應(yīng)的化合物預處理,評價其在鎘暴露中是否存在有保護作用;評估鎘及褪黑素預處理對于sirt1及pgc-1α表達的影響,初步探討褪黑素對鎘暴露的保護機制;③在上一步中建立的鎘暴露模型基礎(chǔ)上,通過sirt1特異性抑制劑sirtinol及sirt1sirna對細胞內(nèi)sirt1分子進行調(diào)控,進一步探討褪黑素保護鎘暴露所致肝毒性的是否通過sirt1/pgc-1α信號通路;通過加用褪黑素受體拮抗劑影響褪黑素受體功能,進一步探討褪黑素的保護作用是否依賴于褪黑素受體機制。研究結(jié)果①濃度為2.5μm的鎘暴露并不能對hepg2細胞的細胞活力、活性氧生成、線粒體膜電位水平、線粒體dna拷貝數(shù)及線粒體質(zhì)量產(chǎn)生影響。但是5μm及10μm的鎘暴露劑量即能對細胞活力、線粒體功能及線粒體生成產(chǎn)生毒性作用。②在5μm的鎘暴露劑量下,加用0.5μm的褪黑素預處理兩小時后,可以觀察到hepg2細胞的細胞活力、活性氧生成、線粒體膜電位水平、線粒體dna拷貝數(shù)及線粒體質(zhì)量較單純鎘暴露組有明顯的上升。鎘處理能夠明顯的抑制sirt1的表達,增加乙�；痯gc-1α的水平;而褪黑素預處理后鎘暴露所導致的sirt1表達降低及乙酰化pgc-1α水平增加都有明顯的抑制。③在上一步建立的褪黑素保護鎘暴露模型上,加用sirt1特異性抑制劑sirtinol及sirt1sirna干擾hepg2細胞內(nèi)sirt1的表達及活性后,褪黑素對于鎘暴露干擾細胞活力、線粒體功能及線粒體生成的保護作用較單純褪黑素預處理組有明顯的下降,同時乙酰化pgc-1α水平也有所上升。在加用褪黑素受體拮抗劑luzindole以后,褪黑素對于因鎘暴露所抑制的sirt1表達及增強的乙�；痯gc-1α的保護作用也有部分的下降。研究結(jié)論根據(jù)本課題的研究結(jié)果,我們可以獲得以下結(jié)論:鎘離子在進入細胞后引起的線粒體功能障礙及生成受損可能是其在急性暴露過程中造成肝毒性的重要原因。鎘通過干擾線粒體的功能生成、影響線粒體的功能水平,影響肝細胞的生物學狀態(tài),從而表現(xiàn)出肝毒性效應(yīng);褪黑素可以通過促進細胞內(nèi)mt1/sirt1/pgc-1α信號通路依賴性的線粒體生成水平,提高線粒體功能狀態(tài),進而保護鎘暴露所致的肝毒性。本課題的研究進一步證實了鎘暴露的肝毒性效應(yīng),并為以后臨床工作中褪黑素被應(yīng)用到急性鎘暴露所導致的肝損傷的治療中提供了一個新的分子學基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：褪黑素 鎘 肝毒性 SIRT1 PGC-1α 褪黑素受體1
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-16
• 第二章 技術(shù)路線圖16-18
• 2.1 鎘的肝毒性的確定16
• 2.2 褪黑素對鎘的肝毒性保護效應(yīng)的確定16-17
• 2.3 褪黑素對鎘的肝毒性保護效應(yīng)機制的探討17-18
• 第三章 材料與方法18-34
• 3.1 主要儀器18
• 3.2 主要試劑18-19
• 3.3 細胞培養(yǎng)及鎘暴露19-21
• 3.4 實驗方法21-22
• 3.5 ROS（Reactive oxygen species generation）水平檢測22-23
• 3.6 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential）測定23-24
• 3.7 線粒體 DNA 拷貝數(shù)（Mt DNA copy number）評價24-26
• 3.8 線粒體質(zhì)量（mitochondrial mass）評價26-27
• 3.9 SIRT1 活性（SIRT1 activity）檢測27-28
• 3.10 免疫沉淀反應(yīng)（ Immunoprecipitation ） / 免疫共沉淀反應(yīng)（ Co-I mmunoprecipitation pull-down assay）28-30
• 3.11 免疫印跡法分析蛋白含量（western blot analysis）30-32
• 3.12 免疫熒光共聚焦顯微鏡（Immunofluorescence confocal microscopy）32-33
• 3.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計33-34
• 第四章 實驗結(jié)果34-58
• 第五章 討論58-64
• 全文總結(jié)64-66
• 參考文獻66-78
• 文獻綜述 鎘引起急性肝毒性機制探討78-98
• 參考文獻89-98
• 攻讀博士在讀期間發(fā)表的論文98-99
• 致謝99

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