本文關鍵詞：miRNA-486-5p抗肺纖維化作用及其機制

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【摘要】：microRNAs (miRNAs)是一類小分子非編碼RNAs,通常通過與靶mRNA3'端非翻譯區(qū)完全或部分互補結(jié)合,導致靶mRNA降解或抑制其翻譯從而調(diào)控靶基因的表達。自從在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)第一種miRNA以來,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾千種miRNAs,其中人類miRNAs種類已經(jīng)超過2500種(miRbase v21) (http://www.mirbase.org/) 。 miRNAs調(diào)控著多種生理過程(包括發(fā)育、增殖、分化凋亡和應激反應等)中重要功能基因的表達。當前研究表明,不同疾病具有特異的miRNA表達譜,如癌癥、炎癥、感染和自身免疫性疾病等。在多種動物模型中,通過敲除和敲入功能性miRNA的研究也進一步證實miRNA表達失調(diào)與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關。肺纖維化是一類由多種病因引起的肺組織損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞、細胞外基質(zhì)沉積、肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑的不可逆性疾病,包括塵肺病和特發(fā)性肺纖維化,由于其纖維化確切的分子機制尚不完全清楚,目前缺乏特效的治療方法。因此,研究肺纖維化進程中miRNA的作用及其機制將為肺纖維化疾病的診斷和治療提供新的線索。我們觀察分析矽肺動物模型不同時期肺組織中miRNA表達譜的變化,通過驗證發(fā)現(xiàn)5種miRNAs與肺纖維化密切相關,接著我們選擇了miRNA-486-5p進行深入研究,探討其在纖維化中可能的作用機制及作為肺纖維化治療靶標的潛在可能性。目的(1)通過分析矽肺動物模型不同時期肺組織中miRNA表達譜變化,篩檢并驗證出一組與矽肺發(fā)生發(fā)展密切相關的miRNAs;(2)通過miR-486-5p模擬物干預矽塵和博來霉素誘導的肺纖維化,明確miR-486-5p的抗纖維化作用；(3)在細胞和分子水平上初步闡明miR-486-5p抗纖維化作用的分子機制。最終為肺纖維化治療靶標提供新的線索。方法用氣管灌注方法構(gòu)建矽塵及博來霉素誘導小鼠肺纖維化動物模型；根據(jù)病理切片結(jié)果選取矽塵誘導小鼠肺纖維動物模型不同時間點各一只小鼠肺組織,提取RNA,用芯片法檢測miRNAs,分析并篩檢出一組差異表達明顯的miRNAs;用qRT-PCR法在矽塵及博來霉素誘導小鼠肺纖維化模型中進一步驗證篩檢出的miRNAs(各時間段6只小鼠肺組織)；qRT-PCR方法檢測矽肺患者血清及肺組織中、特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中miR-486-5p表達水平；尾靜脈注射miR-486-5p模擬物(agomiR-486-5p)干預矽塵和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化,肺組織病理切片HE染色、Masson染色、免疫組織化學染色(a-SMA)及纖維化評分評價干預效果；通過生物信息學軟件預測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-486-5p的直接靶基因；采用qRT-PCR、蛋白免疫印跡方法檢測高、低表達miR-486-5p對成纖維細胞活性的影響；采用CCK-8實驗及流式細胞技術觀察miR-486-5p對TGF-β1所致的成纖維細胞增殖及細胞周期的影響。結(jié)果1. 篩檢并驗證矽肺動物模型不同時間段肺組織中差異表達的miRNAs采用氣管灌注的方法構(gòu)建矽塵及博來霉素誘導小鼠肺纖維化動物模型,然后通過芯片篩檢矽塵誘導小鼠肺纖維化動物模型中各時間點(0天、3天、7天、14天、28天和56天)肺組織中miRNA表達,分析其變化,選擇了17種變化明顯的miRNAs,分別在矽塵和博來霉素誘導肺纖維化模型的小鼠肺組織中進行驗證(每組6只小鼠),發(fā)現(xiàn)5種miRNAs與肺纖維化相關：miR-151-3p、 miR-21、miR-455、miR-486-5p及miR-3107,其中僅miR-21上調(diào),其余miRNAs均呈下調(diào)。2. miR-486-5p能夠抵抗矽塵和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化我們選擇了miR-486-5p進行后續(xù)的研究,首先檢測了矽肺患者血清中miR-486-5p的表達水平,發(fā)現(xiàn)其明顯低于對照組,且壹期、貳期和叁期矽肺患者血清miR-486-5p表達水平均明顯低于對照組。之后又檢測了矽肺和特發(fā)性肺纖維化患者肺移植后病變肺組織中miR-486-5p的表達水平,也發(fā)現(xiàn)均明顯低于正常對照肺組織。因此,我們假設提高miR-486-5p的表達能夠抑制肺纖維化。于是,我們用膽固醇修飾的miR-486-5p模擬物(agomiR-486-5p)干預矽塵和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化,28天肺組織病理切片HE染色及纖維化病理評分均顯示miR-486-5p干預組比矽塵和博來霉素組肺纖維化程度明顯減輕,Masson染色結(jié)果顯示干預組膠原沉積減少,免疫組織化學染色結(jié)果顯示干預組a-SMA表達水平降低,以上結(jié)果均提示在整體動物水平,過表達miR-486-5p可減輕矽塵和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。3. miR-486-5p抑制肺纖維化可能的分子機制用生物信息學軟件預測靶基因,發(fā)現(xiàn)SMAD2和Co16α6為miR486-5p的潛在靶基因,我們用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-486-5p能與SMAD2和Col6a6的3'-UTR結(jié)合,但突變SMAD2和Col6α6 3'-UTR中預測的結(jié)合位點后,miR-486-5p不能與之結(jié)合,提示miR-486-5p可能是通過靶向調(diào)控這兩種靶基因發(fā)揮抑制肺纖維化作用的。為了驗證miR-486-5p是否通過調(diào)控TGF-β1信號通路中重要分子SMAD2來影響肺纖維化發(fā)生發(fā)展的,我們先觀察了TGF-β1處理成纖維細胞后miR-486-5p的表達情況,發(fā)現(xiàn)是下調(diào)的,并且肌成纖維細胞分化標志物a-SMA及細胞外基質(zhì)的重要組分纖粘蛋白(Fn)的mRNA水平均升高。然后,我們將miR-486-5p模擬物轉(zhuǎn)染至成纖維細胞中,構(gòu)建過表達miR-486-5p的細胞模型,用TGF-β1處理細胞,發(fā)現(xiàn)過表達miR-486-5p能降低TGF-β1信號通路中關鍵信號分子P-SMAD2的蛋白表達水平,同時也降低了FN、CTGF及a-SMA蛋白和mRNA的表達水平：而用miR-486-5p抑制劑構(gòu)建低表達細胞模型,則可增強TGF-β1誘導的P-SMAD2蛋白水平,同時也增強了FN、CTGF及α-SMA蛋白及mRNA的表達水平。提示過表達miR-486-5p能抑制成纖維細胞增殖與分泌活性,下調(diào)miR-486-5p則減輕了對SMAD2的抑制水平,也就是增強了TGF-β1信號通路,從而增強成纖維細胞增殖與分泌活性。這些結(jié)果均說明miR-486-5p可能通過干預TGF-β1信號通路調(diào)控肺纖維化進程。為了進一步證明miR-486-5p對成纖維細胞增殖活性的影響,我們做了CCK-8實驗,結(jié)果顯示,與對照組比較,用TGF-β1處理成纖維細胞可促進其增殖,而miR-486-5p可明顯抑制TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖。為了進一步證實miR-486-5p對成纖維細胞增殖的影響,我們用流式細胞儀檢測了細胞周期,結(jié)果顯示TGF-β1可使處于S期細胞數(shù)量增加和G1期細胞數(shù)量減少,而miR-486-5p模擬物可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對細胞周期的這種作用。提示miR-486-5p表達水平的確會影響TGF-β1信號的傳遞從而影響成纖維細胞的增殖與分泌活性。結(jié)論通過對矽肺動物模型肺組織miRNA芯片篩檢與qRT-PCR驗證,我們初步確定了5種miRNAs (miR-21上調(diào),miR-151-3平、miR-455、miR-486-5p和miR-3107下調(diào))與肺纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關；miR-486-5p在矽肺患者血清及肺組織中、特發(fā)性肺纖維化患者肺組織中表達明顯下調(diào)；高表達miR-486-5p可減輕矽塵和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化；在細胞水平初步闡明miR-486-5p可通過TGF-β1信號通路參與肺纖維化進程的分子調(diào)節(jié)機制。本研究的重要發(fā)現(xiàn)是miR-486-5p可能可以作為肺纖維化疾病的治療靶標之一。
【關鍵詞】：microRNAs miR-486-5p 肺纖維化 TGF-β1 SMAD2 Col6α6
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 縮略語4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 前言16-21
• 材料與方法21-45
• 結(jié)果45-67
• 討論67-73
• 全文小結(jié)73-74
• 參考文獻74-85
• 文獻綜述85-116
• 參考文獻100-116
• 發(fā)表文章、參加會議、培訓及獲獎情況目錄116-119
• 致謝119-120

【共引文獻】

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本文編號：1058959