本文關(guān)鍵詞：幾種有機(jī)熒光傳感器的合成及其在內(nèi)源性生物酶和硫醇檢測(cè)中的應(yīng)用研究

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【摘要】：近年來(lái),有機(jī)熒光傳感器成為化學(xué)、環(huán)境和生物等學(xué)科及其交叉學(xué)科的研究熱點(diǎn),這是因?yàn)橛袡C(jī)熒光傳感器具有合成過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉、能實(shí)現(xiàn)識(shí)別手段多樣化等優(yōu)點(diǎn)。而且有機(jī)熒光傳感器在測(cè)試的過(guò)程中操作簡(jiǎn)單,樣品不需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理工序,能對(duì)被檢測(cè)物進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè),同時(shí)還有很好的細(xì)胞膜穿透性,能對(duì)活體細(xì)胞和活體組織進(jìn)行跟蹤成像,因此具有很好的生物應(yīng)用前景。本文通過(guò)設(shè)計(jì)合成三種基于不同熒光響應(yīng)機(jī)理的有機(jī)熒光傳感器,分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)人體內(nèi)源性生物酶和小分子生物硫醇的定量檢測(cè)和生物成像。首先,我們?cè)O(shè)計(jì)合成了一種基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)機(jī)理的堿性磷酸酶(ALP)熒光探針。該探針是由一種黃酮類熒光團(tuán)上的羥基修飾上磷酸基團(tuán)制備而成,該磷酸基團(tuán)具有雙重功能:阻斷熒光團(tuán)發(fā)生ESIPT效應(yīng)和作為堿性磷酸酶發(fā)生特異性水解反應(yīng)的響應(yīng)基團(tuán)。當(dāng)磷酸基團(tuán)存在時(shí),探針?lè)肿又辛u基被保護(hù)起來(lái),因此無(wú)法發(fā)生ESIPT效應(yīng),熒光團(tuán)互變異構(gòu)體的熒光被淬滅,當(dāng)有堿性磷酸酶存在時(shí),磷酸酶催化水解磷酸基團(tuán),放出熒光團(tuán)上的羥基,因此可以實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)互變異構(gòu),發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。該探針體系具有很好選擇性和很低的檢測(cè)下限,檢測(cè)下限達(dá)到了0.032 U/L,并且可以用于實(shí)際生物樣品,如血清中堿性磷酸酶的測(cè)定。與此同時(shí),我們?cè)O(shè)計(jì)的探針?lè)肿雍苋菀妆患?xì)胞攝取,并且具有很低的細(xì)胞毒性,可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)生的堿性磷酸酶進(jìn)行生物成像。其次,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種巧妙的比率型熒光傳感體系用于透明質(zhì)酸酶(HAase)檢測(cè),該體系是基于透明質(zhì)酸(HA)誘導(dǎo)的激基締合物發(fā)射,并能對(duì)HAase進(jìn)行靈敏檢測(cè),檢測(cè)下限達(dá)0.007 U/mL。通過(guò)合成正電荷芘衍生物N-Py,利用靜電相互作用的原理使得N-Py與帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸分子結(jié)合形成聚集體系,發(fā)出激基締合物的熒光。當(dāng)HAase加入到傳感體系中,HAase催化水解透明質(zhì)酸生成小片段,破壞了N-Py的激基締合物狀態(tài),形成激發(fā)單體狀態(tài),發(fā)出激發(fā)單體的熒光。這種激基締合物-激發(fā)單體的熒光比率信號(hào)轉(zhuǎn)換可以用來(lái)檢測(cè)HAase含量。探針?lè)肿釉谛纬杉せ喓衔锖笮枰梢?jiàn)光激發(fā),紅光發(fā)射,這一性質(zhì)使得體系能較好地消除生物樣品的自熒光干擾,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)測(cè)試體系還成功被用于人尿液中HAase的檢測(cè),并取得令人滿意的準(zhǔn)確度。該HAase傳感體系的設(shè)計(jì)策略可以為其他熒光比率型生物酶?jìng)鞲衅鞯脑O(shè)計(jì)提供參考和思路。最后,我們將兩種熒光團(tuán)組合制備出了一種能對(duì)硫醇進(jìn)行特異性響應(yīng)的熒光探針。該探針具有雙硫醇響應(yīng)機(jī)制,通過(guò)與不同硫醇反應(yīng)后,在不同波長(zhǎng)激發(fā)下發(fā)出兩種獨(dú)立的近紅外和綠色熒光發(fā)射信號(hào),來(lái)同時(shí)對(duì)GSH和Cys/Hcy進(jìn)行區(qū)分。該探針是由花菁類熒光團(tuán)NR-OH與NBD基團(tuán)通過(guò)醚鍵相連得到,連接處即為GSH和Cys/Hcy的響應(yīng)位點(diǎn)。該探針由于存在從NR-OH基團(tuán)到NBD基團(tuán)的ICT效應(yīng),因此本身沒(méi)有熒光。當(dāng)GSH加入后,探針體系會(huì)在716 nm處發(fā)出NR-OH的熒光,而另外一種產(chǎn)物NBD-GSH由于硫原子的淬滅作用而不能發(fā)出熒光。當(dāng)Cys/Hcy加入后,由于這兩種硫醇接上NBD基團(tuán)后能發(fā)生分子內(nèi)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換,不存在淬滅作用,因此在470和670 nm光激發(fā)下,會(huì)發(fā)出兩種獨(dú)立的熒光發(fā)射,分別為550和716 nm。這種有區(qū)別的熒光發(fā)射方式可以用來(lái)同時(shí)區(qū)分GSH和Cys/Hcy。該探針還能應(yīng)用于人血清樣品中硫醇的檢測(cè),在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒性,并且能在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行成像。因此,該探針體系可提供一種有用的方法用于進(jìn)一步闡明硫醇的生物作用和跟硫醇相關(guān)的疾病病理分析。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：O657.3;TP212

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