【摘要】：疾病是困擾當前養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要難題,而從遺傳本質上提高豬抗病性能是解決這一問題的關鍵�？共⌒誀疃鄬儆趶碗s性狀且易受環(huán)境影響,存在許多經典遺傳學無法解釋的現象。表觀遺傳學的發(fā)展為人們理解抗病性狀的遺傳調控機制及抗病基因分子標記檢測提供了新的角度。而目前極少有研究探索豬疾病的表觀遺傳調控。因此,本研究采用全基因組轉錄組測序和甲基化測序相結合的策略,探究豬外周單核細胞(PBMCs)抗病毒免疫應答過程中基因表達、DNA甲基化狀態(tài)變化以及DNA甲基化對免疫相關基因表達的調控機制,以期從表觀遺傳學角度揭示其抗病及免疫應答的調控機理,獲得增強免疫反應相關的基因及DNA甲基化標識,從而為豬的分子抗病育種提供新的依據。本研究以雙鏈RNA病毒模擬物Poly I:C作為免疫刺激劑,開展PBMCs體外抗病毒免疫反應試驗。通過檢測不同Poly I:C作用濃度和時間免疫相關基因(IL6、IL8、TNFα、IFNα、 IFNγ、IRF3、TLR3)的表達水平,確定最佳作用濃度和時間為20 ug/ml、24 h。以35日齡的大蒲蓮、長白仔豬各3頭為試驗材料,分離其PBMCs。每個個體PBMCs均分為2份,處理組添加Poly I:C至終濃度為20 ug/ml,對照組添加PBS,同時培養(yǎng)24 h。比較分析Poly I:C刺激和對照PBMCs轉錄組及全基因組DNA甲基化差異。比較分析兩品種豬基因表達模式差異,獲得大蒲蓮豬特異性差異表達基因218個、長白豬特異性差異表達基因226個(FDR0.05),其中大蒲蓮豬有更多基因富集到免疫相關功能條目。與前期豬抗病毒免疫應答研究結果比較,獲得7個(LAGS、DUSP1、MGPMS4A7、 DNM1、CYPIA1、HNF4A)可能影響豬抗病毒免疫應答反應的候選基因。本研究構建了豬PBMCs全基因組甲基化圖譜,并揭示了其DNA甲基化特征：CpG密度為51-55個CpGs/kb、CpGo/e比例約為0.6的序列具有更高的甲基化水平,染色體亞端粒區(qū)甲基化水平顯著高于非亞端粒區(qū),甲基化水平在TSS附近顯著下降、基因本體內顯著升高,CpG島甲基化水平高于CpG岸。差異甲基化分析檢測出5,827差異甲基化區(qū)域(DMRs),涉及1,890個差異甲基化基因,其中68個基因差異甲基化且差異表達。Poly I:C刺激后,PACSIN1基因啟動子甲基化水平顯著升高,而nRNA表達顯著降低。啟動子甲基化功能研究表明,DNA甲基化可通過抑制啟動子轉錄活性而抑制PACSIN1基因的表達。RNAi試驗顯示,PACSIN1基因沉默可促進IL6、IL8、TNFα、NECAP2的表達。上述結果表明,DNA甲基化可通過降低啟動子的轉錄活性而抑制PACSIN1基因的表達,該基因低表達促進促炎性細胞因子的生成,進而增強免疫應答反應。本研究建立了Poly I:C誘導豬PBMCs體外分析模型,揭示了抗病毒反應過程中PBMCs基因表達和全基因組DNA甲基化水平變化以及DNA甲基化對免疫相關基因的表達調控作用。本研究將加深人們對抗病毒反應中表觀遺傳調控作用的認識,獲得的豬PBMC DNA甲基化數據有望作為豬表觀基因組數據資源的一部分,用于豬表觀遺傳流行病學研究以及組織特異性甲基化模式分析研究中。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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