【摘要】：自然界中,病原卵菌能夠分泌RxLR類效應(yīng)因子到寄主細(xì)胞中操控寄主體內(nèi)的生理生化過程,從而有效生長(zhǎng)和繁殖,導(dǎo)致寄主感病。葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola(Berk.and Curt.)Berl.and de Toni)是嚴(yán)格的活體營(yíng)養(yǎng)專性寄生卵菌,其引起的葡萄霜霉病(downy mildew)是威脅全世界葡萄生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一。本實(shí)驗(yàn)室利用RNA-Seq的方法從葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'中分析得到了 31個(gè)候選RxLR效應(yīng)因子,然而它們?cè)谇秩炯闹鬟^程中扮演的角色尚不清楚。因此,在本研究中,我們對(duì)這些候選RxLR效應(yīng)因子進(jìn)行特征及功能分析,并重點(diǎn)研究了兩個(gè)效應(yīng)因子的功能及對(duì)病原菌毒性的貢獻(xiàn),為葡萄-霜霉菌互作機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。從葡萄霜霉菌菌株'ZJ-1-1'預(yù)測(cè)的31個(gè)RxLR效應(yīng)因子中成功克隆了 23個(gè),這些效應(yīng)因子在不同侵染時(shí)期的表達(dá)模式主要分為四種類型。利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙的方法,我們發(fā)現(xiàn)17個(gè)效應(yīng)因子能夠完全抑制6種不同細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白(BAX、INF1、PsCRN63、PsojNIP、PvRxLR16和R3a/Avr3a)激發(fā)的程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD)反應(yīng),表明被研究的這些效應(yīng)因子大多數(shù)具有廣譜抑制PCD的功能。在本氏煙細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),16個(gè)RxLR效應(yīng)因子定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),6個(gè)效應(yīng)因子特異性定位于細(xì)胞核,僅有一個(gè)定位于細(xì)胞膜,表明細(xì)胞核是RxLR效應(yīng)因子在植物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)功能的重要部位之一。為了明確葡萄RxLR效應(yīng)因子對(duì)植物先天免疫的影響,我們選擇了表達(dá)時(shí)間最早,表達(dá)量最高,并且能夠廣譜抑制PCD的PvRxLR28進(jìn)行深入研究。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蛋白的C端是其功能結(jié)構(gòu)域,抑制PCD的功能依賴于細(xì)胞核定位。瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)研究結(jié)果顯示,PvRxLR28能夠顯著性提高葡萄和本氏煙對(duì)病原菌的感病性,同時(shí)還降低了轉(zhuǎn)基因植株中活性氧的含量和抗病相關(guān)基因的表達(dá)量。表明PvRxLR28可能是作為PCD廣譜抑制因子操控植物的免疫反應(yīng)。PvRxLR16是唯一能夠激發(fā)本氏煙細(xì)胞死亡的效應(yīng)因子,特異性定位于植物細(xì)胞核。我們對(duì)它的不同缺失突變體、點(diǎn)突變體和定位突變體進(jìn)行功能分析,發(fā)現(xiàn)W/Y/L結(jié)構(gòu)域、預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn)Asn-240及核定位對(duì)于引起細(xì)胞死亡的功能是必需的。利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)方法驗(yàn)證了PvRxLR16被本氏煙識(shí)別激發(fā)細(xì)胞壞死是通過ETI途徑中SGT1、Hsp90和RAR1介導(dǎo)的,而不依賴于PTI反應(yīng)中的Serk3。運(yùn)用同樣的方法,發(fā)現(xiàn)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的激酶和轉(zhuǎn)錄因子也參與了 PvRxLR16被識(shí)別的信號(hào)通路。瞬時(shí)表達(dá)PvRxLR16還能夠激發(fā)本氏煙活性氧的積累和抗病相關(guān)基因的表達(dá)從而提高對(duì)辣椒疫霉菌的抗性。然而,PvRxLR16激發(fā)的這些防御反應(yīng)又能被其他的PvRxLRs所抑制,表明在自然條件下它可能不會(huì)激發(fā)植物免疫反應(yīng)。通過酵母雙雜交(Y2H)技術(shù)篩選出了 PvRxLR16在葡萄中的靶蛋白VaCUE,并利用雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)和免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)加以驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn),二者互作也依賴于PvRxLR16的W/Y/L結(jié)構(gòu)域和三個(gè)預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)。VaCUE表達(dá)受到葡萄霜霉菌的誘導(dǎo),但是具體功能以及受PvRxLR16調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Ｃｏｌｌｉｅｒ邋ａｎｄ邋Ｍｏｆｆｅｔｔ，邋２００９）。它們之間識(shí)別的分子機(jī)制一直是植物與病原菌互作的研究逡逑熱點(diǎn)。在過去的十幾年中，大量的研巧人員致力于探索病原菌基因是如何被植物基因識(shí)別逡逑的。研巧表明，病原菌與寄主之間的識(shí)別機(jī)制主要分為直接和間接兩種方式（圖１－２），而互作模逡逑式可Ｗ分為Ｗ下幾種；逡逑１．２．１經(jīng)典受體－配體模式逡逑該模式認(rèn)為，植物Ｒ蛋白（受體）與病原菌Ａｔ基因的編碼產(chǎn)物（配體）直接相互作用，觸逡逑發(fā)侵染位點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞過程，從而激發(fā)寄主植物的防衛(wèi)反應(yīng)產(chǎn)生抗病性（Ｇａｂｒｉｅｌ邋ａｎｄ邋Ｒｏ抵，逡逑１９９０）。這種直接識(shí)別模式在真菌與植物互作中發(fā)現(xiàn)較多，例如水稻抗病蛋白Ｐｉ拉的Ｎ端ＬＲＲ結(jié)逡逑構(gòu)域能夠直接與稻遍菌Ａｖｒ－Ｐｉｔａ效應(yīng)因子互作，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病逡逑反應(yīng)。而該ＬＲＲ結(jié)構(gòu)域中一個(gè)關(guān)鍵氨基酸的突變能夠影響二者識(shí)別作用導(dǎo)致寄主喪失抗病性（Ｊｉａ逡逑Ｗａ／．，２０００）。亞麻抗鎊病基因Ｌ５、Ｌ６和Ｌ７能與亞麻鑄菌無毒基因直接互作激活免疫反逡逑應(yīng)（Ｄｏｄｄｓ邋ｗａ／．，２００６）。后期研巧發(fā)現(xiàn)，將ＡｖｒＬ５６７蛋白晶體結(jié)構(gòu)表面的幾個(gè)氨基酸突變之后會(huì)破逡逑壞其與抗病蛋白的互作（Ｗａｎｇ幻ａ／．，２００７）。另外，亞麻抗病蛋白Ｍ同樣是Ｗ直接互作的方式與亞逡逑麻誘菌效應(yīng)蛋白ＡｖｒＭ互作（Ｃａｔａｎｚａｒｉｔｉ邋Ｗ邋ａ／．

圖１－３葡萄霜霉病的危害及葡萄霜霉菌的形態(tài)特征（Ｇｃｓｓｌｅｒｗａ／．．２０Ｕ）逡逑Ｆｉｇｕ代邋１－３邋Ｄａｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｇ巧ｐｅｖｉｎｅ邋ｄｏｗｎｙ邋ｍｉｌｄｅｗ邋ａｎｄ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋Ｐ邋ＷｎＶｕ／ｕ逡逑（Ｇｅｓｓｋｒ邋ｅ？邋ｆｌ／．，２０Ｕ邋）逡逑霜霉菌形態(tài)特征及致病過程逡逑霉病的病原菌是葡萄單軸霜霉［／Ｖａｓｗｏｐｗｏ邋ｖｖＹ／＇ｃｏ／ｆｌ＾ｅｒｋ．邋＆邋Ｃｕｒｔ．）邋Ｂｅｒｌ．邋＆邋ｄｅ邋Ｔｏｎｉ］，卵菌綱，霜霉目，單軸霉屬（Ｇｅｓｓｌｅｒｅ／曰／．，２０１１）。該病原菌是二倍體活體營(yíng)養(yǎng)型能夠在葡萄細(xì)胞間擴(kuò)展蔓延，通過形成球狀吸器深入到植物細(xì)胞內(nèi)吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)簇生，成束從葉片遠(yuǎn)軸面的氣孔伸出，大小為４００－７８０邋ｎｍｘ６－ｎｎｍ，單軸近直角般為２－３次，分枝末端有２－３個(gè)圓錐形小梗，末端純，小梗上著生著抱子囊（董子囊無色，單胞，卵形或楠圓形，有乳狀突起。在條件適宜的情況下，抱子囊萌發(fā)抱子（王葉|!和李云，１９８８）。游動(dòng)抱子腎臟形，扁平端側(cè)生兩根鞭毛，能在水中，抱子游動(dòng)半個(gè)小時(shí)后鞭毛開始收縮直至變成圓形而停止活動(dòng)（Ｋｉｅｆｅｒ邋ｅ／ａ／．，，２００２１５分鐘后圓形抱子開始萌發(fā)產(chǎn)生芽管，從葡萄葉片背面氣孔侵入體內(nèi)。在侵染病原菌開始有性生殖，在其侵染發(fā)病部位形成卵抱子，卵抱子褐色、近球形、外起伏。其存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年，第二年春天溫度達(dá)到ｉｒｃ后，在一定濕度下卵
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S436.631

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2543299