【摘要】：高溫對(duì)動(dòng)物生理調(diào)節(jié)及生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有顯著影響;此外,溫度在限制物種地理分布方面也發(fā)揮重要作用。熱應(yīng)激(HS)是由于高溫引起的一系列動(dòng)物機(jī)體障礙,主要包括熱痙攣,熱損傷和熱休克。研究表明,了解熱應(yīng)激相關(guān)生理機(jī)制對(duì)于區(qū)別生理性和病理性熱損傷非常重要。熱應(yīng)激損傷受到炎癥反應(yīng)和自身穩(wěn)態(tài)修復(fù)的雙重調(diào)節(jié)。一般而言,熱應(yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物體溫升高,心率加速和大量出汗,進(jìn)而影響生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)以雄性小鼠為動(dòng)物模型,研究了熱應(yīng)激對(duì)小鼠生理參數(shù)以及垂體蛋白表達(dá)的影響,詳述如下:1-熱應(yīng)激對(duì)小鼠行為和生理參數(shù)的影響本試驗(yàn)探究熱應(yīng)激對(duì)小鼠行為和生理參數(shù)的影響,包括行為、體重、飲水量、采食量和直腸溫度。試驗(yàn)以36只成年雄性小鼠(體重約50g)為研究對(duì)象,隨機(jī)分為3組(A、B和C),每組12只。其中,A、B兩組為熱應(yīng)激組,分別于30℃和40℃進(jìn)行熱應(yīng)激處理2 h/d,為期15天;C組為對(duì)照組,在室溫下(25℃)飼養(yǎng)。試驗(yàn)期間,連續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠直腸溫度,每天記錄采食量和飲水量,并測(cè)量熱處理前后的體重變化。研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激引起了小鼠顯著的行為變化,表現(xiàn)為:熱處理時(shí)皮毛粗糙、油膩,并產(chǎn)生逃逸行為,如為逃避高溫咬籠子線。生理參數(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn):B組小鼠直腸溫度升高(36.57±0.57到38.01±0.45℃),但與A組相比,差異不顯著;兩試驗(yàn)組小鼠飲水量顯著增加;B組小鼠體重由46.86減輕到42.15±3.55g,A組小鼠體重由46.06減少至44.68±5.01g,差異顯著;各組間采食量無顯著差異。上述結(jié)果表明:熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生逃逸行為,使直腸溫度及飲水量上升,體重降低。2-熱應(yīng)激對(duì)小鼠激素水平和睪丸組織形態(tài)的影響本試驗(yàn)探究熱應(yīng)激對(duì)小鼠內(nèi)分泌功能的影響。小鼠被隨機(jī)分為3組,每組12只,A組和B組分別每天在30℃和40℃條件下兩小時(shí),持續(xù)15天,C組一直在室溫(25℃)條件下作為對(duì)照組。第7天和第15天熱處理后采集血樣,離心后收集血清保存,利用放射免疫測(cè)定法對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、睪酮及生長(zhǎng)激素含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,兩處理組血清睪酮水平在第15天時(shí)顯著下降;生長(zhǎng)激素含量在第7天時(shí)較低,但與其第15天時(shí)的含量無顯著差異。與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組小鼠ACTH含量在第7天時(shí)顯著降低,第15天時(shí)ACTH含量略有增加。此外,熱應(yīng)激對(duì)睪丸組織形態(tài)的影響也進(jìn)行了檢測(cè)。采集睪丸組織后,福爾馬林固定,酒精梯度脫水,常規(guī)石蠟包埋,制成5μm切片。蘇木精-伊紅染色(HE)發(fā)現(xiàn),高溫(40℃)嚴(yán)重?fù)p害睪丸組織。在4℃應(yīng)激組小鼠的曲細(xì)小管萎縮,精子含量少,睪丸變性,曲細(xì)精管排列不規(guī)則,生精阻滯和睪丸間質(zhì)細(xì)胞萎縮。綜上,這些結(jié)果表明,熱應(yīng)激導(dǎo)致雄性小鼠激素失衡,繁殖性能下降,可能影響精子發(fā)生而造成不育。3- iTRAQ分析熱應(yīng)激對(duì)小鼠腦垂體蛋白表達(dá)的影響本試驗(yàn)利用iTRAQ芯片技術(shù)分析熱應(yīng)激小鼠垂體的蛋白反應(yīng)。試驗(yàn)對(duì)垂體中的564種蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明,與對(duì)照組(RT)相比,40℃熱應(yīng)激組共有374種蛋白質(zhì)表達(dá)差異,其中,89種蛋白上調(diào),285種下調(diào)。在564種蛋白質(zhì)中,已確定與應(yīng)激有關(guān)的蛋白有130種,其中有26種蛋白表達(dá)上調(diào),46種蛋白下調(diào)。7種熱休克蛋白表達(dá)差異顯著:其中,2種蛋白屬于HSP70家族、1種蛋白屬于HSP90家族,它們顯著上調(diào);而HSP90和HSP84b的表達(dá)均下調(diào)。HSP70(HSPAlB)和NMNAT3顯著高表達(dá),達(dá)到對(duì)照組的6.9和6.64倍。而中間絲相關(guān)蛋白家族(IP)包括,核纖層蛋白(prelamin-a/C和核纖層蛋白B)、波形蛋白、角蛋白均表達(dá)上調(diào)。在這里,中間絲蛋白和熱休克蛋白作為生物標(biāo)志物證實(shí)了熱應(yīng)激與蛋白質(zhì)水平變化相關(guān)聯(lián)。熱應(yīng)激時(shí),小鼠垂體A-IV表達(dá)水平上調(diào),這可能與熱應(yīng)激期間低采食量有關(guān)。此外,我們將差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了功能富集。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)蛋白中,37個(gè)蛋白與刺激反應(yīng)相關(guān),其中26個(gè)與應(yīng)激有關(guān);下調(diào)蛋白中,99個(gè)蛋白與刺激反應(yīng)相關(guān),其中46個(gè)與應(yīng)激有關(guān)。同時(shí),試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)對(duì)6個(gè)熱休克蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,HSP70基因表達(dá)水平顯著上調(diào)(hsp1b),與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。HSPa5, HSP84b和HSP 90B基因mRNA表達(dá)水平?jīng)]有變化,而HSP90A mRNA的表達(dá)與蛋白芯片結(jié)果一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果,試驗(yàn)利用western blot技術(shù)測(cè)定了4個(gè)差異表達(dá)蛋白的含量。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比(RT) , 40℃組小鼠垂體中NMAT3和HSPlab表達(dá)上調(diào),而HSP60和HSP90a表達(dá)下調(diào),可能與肌動(dòng)蛋白的內(nèi)部控制有關(guān)。這些結(jié)果從轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)兩個(gè)水平上驗(yàn)證了iTRAQ蛋白芯片的準(zhǔn)確性。綜上結(jié)果表明,這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能在緩解熱應(yīng)激方面起到重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.3

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