發(fā)布時間：2017-04-20 08:00

  本文關鍵詞：PKC誘導紅細胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細胞噬紅細胞作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人紅細胞的平均壽命為100~120天,正常人體內(nèi)大約存在3×1013個紅細胞。每天,有超過2×1011個紅細胞被替換。紅細胞在體內(nèi)經(jīng)歷成熟、衰老,最終被脾、肝、骨髓等處的巨噬細胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的紅細胞往往呈現(xiàn)較弱的細胞形變以及形變恢復能力,使之易于被脾臟滯留,從而被吞噬細胞吞噬以及消化。巨噬細胞對凋亡細胞的識別主要通過其表面的受體來進行的。成熟哺乳動物的紅細胞沒有細胞核以及細胞器等,紅細胞膜的異常(如帶3蛋白交聯(lián),錨蛋白外翻)觸發(fā)了巨噬細胞表面的受體分子與其識別,接著黏附、吞噬和分解。然而,膜蛋白的異常導致的紅細胞過早清除或者凋亡障礙與多種血液疾病相關,如膜蛋白缺陷、阿爾茨海默癥以及高原紅細胞增多癥。同樣在血液保存中,膜蛋白的異常與否往往與血液保存時間的長短有關。探其根源,紅細胞膜蛋白的異常以及紅細胞程序性死亡與紅細胞胞內(nèi)的PKC激活密切相關。因此,本文通過PMA激活紅細胞胞內(nèi)的PKC,從而探討激活的PKC與紅細胞錨蛋白外翻的關系以及誘導紅細胞錨蛋白外翻的機制問題,也進一步探索了激活的PKC誘導紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的變化與紅細胞形變能力的相關關系。希望為深入了解紅細胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)以及治療膜蛋白異常的相關血液疾病,同時也對研究人工紅細胞的膜骨架蛋白與紅細胞變形性能、血液保存過程中血液保存時間的延長等提供細胞和分子層面的探索機理。紅細胞錨蛋白為膜內(nèi)在蛋白,只有當錨蛋白外翻到細胞膜的外側(cè)且錨蛋白RGD序列端也暴露在細胞表面時,巨噬細胞表面的受體分子整合素αvβ3才能與之識別、黏附和吞噬。本研究論文通過PMA激活紅細胞胞內(nèi)的PKC來判斷與紅細胞程序性死亡緊密相關的胞內(nèi)PKC的激活能否誘導紅細胞錨蛋白的外翻。結(jié)果表明,激活的PKC能夠誘導紅細胞錨蛋白外翻到紅細胞膜外側(cè),然而錨蛋白外翻的紅細胞的比例呈PMA濃度依賴關系,而且錨蛋白外翻的紅細胞的比例體現(xiàn)出血液捐獻者的個體差異性。這意味著盡管PMA誘導PKC的激活能夠促使紅細胞錨蛋白的外翻,但是錨蛋白外翻的紅細胞的比例與胞內(nèi)游離的PKC對PMA的敏感性以及紅細胞胞內(nèi)PKC活性的異質(zhì)性有關。為了探討外翻的錨蛋白與整合素αvβ3的結(jié)合能否介導巨噬細胞與紅細胞的黏附,本文通過對巨噬細胞黏附紅細胞的檢測以及封閉整合素αvβ3(封閉膜上的結(jié)合位點)和錨蛋白(封閉巨噬細胞表面的結(jié)合位點)的結(jié)合位點分析。結(jié)果表明,錨蛋白的外翻能誘發(fā)巨噬細胞的噬紅細胞作用,結(jié)合位點的封閉能明顯降低巨噬細胞對紅細胞的黏附數(shù)量。紅細胞程序性死亡往往起始于細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。提高的胞內(nèi)鈣離子濃度能夠激活半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶以及鈣依賴的酶,從而降解細胞骨架及分解蛋白質(zhì),導致細胞囊泡化等,最終細胞調(diào)亡。PKC是一種鈣離子依賴的酶,激活的PKC能夠誘導細胞胞外鈣離子的快速流入,促使其胞內(nèi)鈣離子水平的升高。同時激活的PKC也能誘導紅細胞膜蛋白的磷酸化,從而導致紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的減弱。因此,本文運用PKC的抑制劑Calphostin C(封閉PKC的激活位點)和Chelerythrine chloride(競爭性抑制激活的PKC的磷酸化作用位點)來分析鈣離子以及錨蛋白的磷酸化與紅細胞錨蛋白外翻的關系。結(jié)果表明,激活的PKC誘導細胞胞外鈣離子的流入以及錨蛋白的磷酸化作用共同促使紅細胞錨蛋白的外翻。此外,研究也表明僅僅是胞內(nèi)鈣離子水平的增加或者僅僅錨蛋白的磷酸化作用均不足以誘導紅細胞錨蛋白的外翻。為了進一步探討激活的PKC與紅細胞錨蛋白外翻的關系。本文通過不連續(xù)密度梯度離心法分離出老紅的紅細胞層,檢測其錨蛋白外翻、胞內(nèi)鈣離子以及錨蛋白磷酸化水平的情況。也檢測了PMA誘導不同密度層紅細胞的上述指標變化情況。結(jié)果表明,在老化層中有一定數(shù)目的紅細胞呈現(xiàn)其錨蛋白的外翻。同時PMA對不同密度層紅細胞的錨蛋白外翻以及胞內(nèi)鈣離子有不同的影響(對不同密度層紅細胞錨蛋白的磷酸化水平影響卻不大)。這意味著在老化的紅細胞中存在著紅細胞程序性死亡的信號分子—錨蛋白外翻,同時也進一步確認了誘發(fā)紅細胞錨蛋白外翻的兩個必不可必少的條件(胞內(nèi)鈣離子水平的增加以及紅細胞錨蛋白的磷酸化作用)。本論文還檢測了PKC誘導的錨蛋白外翻對紅細胞變形性能的影響,以及PKC誘導的膜蛋白磷酸化作用導致膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細胞形變能力的變化關系。結(jié)果顯示,錨蛋白的外翻能夠引起紅細胞變形性能的減弱,錨蛋白的磷酸化作用引起的紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的改變與紅細胞變形指數(shù)的變化關系不大,而蛋白4.1的磷酸化作用誘導的紅細胞膜骨架結(jié)合親和力的改變在紅細胞形變能力的變化關系中有著重要的作用。因此,錨蛋白的外翻以及膜骨架結(jié)合親和力的減少誘導的紅細胞形變能力的減弱進一步促進了巨噬細胞對該紅細胞的黏附。根據(jù)現(xiàn)有的研究成果和已發(fā)表的文獻,我們推斷出激活的PKC一方面誘導了細胞胞外鈣離子的流入,然后胞內(nèi)鈣離子水平的提高激活了鈣離子依賴的酶,促使了細胞的囊泡化和膜蛋白結(jié)合親和力的減少,另一方面激活的PKC誘導的紅細胞錨蛋白的磷酸化,進一步減弱膜骨架蛋白的相互作用,經(jīng)過這兩方面的相互作用,誘導了紅細胞錨蛋白的外翻,最終導致巨噬細胞的噬紅細胞作用。
【關鍵詞】：紅細胞 錨蛋白外翻 PKC 紅細胞變形性能
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R331.1
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 中英文縮略詞列表11-12
• 1 緒論12-24
• 1.1 研究背景12-19
• 1.1.1 紅細胞程序性死亡12-14
• 1.1.2 紅細胞力學性能與紅細胞程序性死亡14-16
• 1.1.3 PKC與紅細胞程序性死亡16-19
• 1.2 問題的提出和研究意義19-21
• 1.2.1 問題的提出19-20
• 1.2.2 研究意義20-21
• 1.3 研究內(nèi)容和目的21-22
• 1.4 本課題的創(chuàng)新點22-24
• 2 PKC對紅細胞錨蛋白外翻的影響24-38
• 2.1 引言24-27
• 2.2 材料和方法27-32
• 2.2.1 PMA誘導紅細胞錨蛋白外翻的檢測27-29
• 2.2.2 PKC抑制劑對PMA誘導紅細胞錨蛋白外翻的檢測29-31
• 2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析31-32
• 2.3 實驗結(jié)果32-35
• 2.3.1 PMA對紅細胞錨蛋白外翻的影響32-33
• 2.3.2 PKC抑制劑對PMA誘導紅細胞錨蛋白外翻的影響33-35
• 2.4 分析與討論35-36
• 2.5 本章小結(jié)36-38
• 3 PKC誘導細胞胞外的鈣離子流入對紅細胞錨蛋白外翻的影響38-50
• 3.1 引言38-39
• 3.2 材料與方法39-44
• 3.2.1 PKC抑制劑對PMA誘導紅細胞胞內(nèi)鈣離子水平變化的檢測39-41
• 3.2.2 胞內(nèi)鈣離子與錨蛋白外翻紅細胞的熒光雙標檢測41-43
• 3.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析43-44
• 3.3 實實驗結(jié)果44-47
• 3.3.1 PKC抑制劑對PMA誘導紅細胞胞內(nèi)鈣離子含量的影響44-46
• 3.3.2 胞內(nèi)鈣離子對紅細胞錨蛋白外翻的影響46-47
• 3.4 分析與討論47-48
• 3.5 本章小結(jié)48-50
• 4 PKC誘導膜蛋白磷酸化對紅細胞錨蛋白外翻的影響50-66
• 4.1 引言50-51
• 4.2 材料與方法51-60
• 4.2.1 紅細胞膜蛋白和胞間蛋白的提取51-53
• 4.2.2 錨蛋白的分離與純化53-54
• 4.2.3 紅細胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度膠）54-57
• 4.2.4 紅細胞PKC、錨蛋白和磷酸絲氨酸的免疫印跡57-59
• 4.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析59-60
• 4.3 實驗結(jié)果60-63
• 4.3.1 紅細胞錨蛋白的分離、純化和錨蛋白的磷酸化檢測60-61
• 4.3.2 時間依賴的錨蛋白磷酸化檢測61-62
• 4.3.3 紅細胞胞內(nèi)PKCα 的激活檢測62-63
• 4.4 分析與討論63-64
• 4.5 本章小結(jié)64-66
• 5 錨蛋白外翻對紅細胞力學性能的影響以及巨噬細胞對錨蛋白外翻紅細胞的噬紅細胞作用66-78
• 5.1 引言66
• 5.2 材料與方法66-72
• 5.2.1 PMA誘導紅細胞錨蛋白外翻的力學性質(zhì)檢測66-69
• 5.2.2 PMA誘導THP-1 分化成巨噬細胞以及其對錨蛋白外翻紅細胞的識別69-71
• 5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析71-72
• 5.3 實驗結(jié)果72-74
• 5.3.1 PMA誘導的錨蛋白外翻對紅細胞形變能力的影響72-73
• 5.3.2 巨噬細胞對PMA誘導的錨蛋白外翻紅細胞的黏附影響73-74
• 5.4 分析與討論74-75
• 5.5 本章小結(jié)75-78
• 6 不同天齡紅細胞錨蛋白外翻的檢測以及PKC對不同天齡紅細胞錨蛋白外翻的影響78-92
• 6.1 引言78-79
• 6.2 材材料和方法79-85
• 6.2.1 密度剃度離心法分離不同天齡的紅細胞79-80
• 6.2.2 不同天齡紅細胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的測定以及PMA對不同天齡紅細胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的影響80-83
• 6.2.3 不同天齡紅細胞錨蛋白磷酸化的測定以及PMA對不同天齡紅細胞錨蛋白磷酸化的影響83-84
• 6.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析84-85
• 6.3 實驗結(jié)果85-88
• 6.3.1 密度剃度離心分離不同天齡的紅細胞85-86
• 6.3.2 紅細胞錨蛋白外翻和胞內(nèi)鈣離子的測定86-88
• 6.3.3 紅細胞錨蛋白磷酸化的測定88
• 6.4 分析討論88-89
• 6.5 本章小結(jié)89-92
• 7 PKC誘導膜骨架結(jié)合親和力的變化對脊椎生物紅細胞力學性能的影響92-108
• 7.1 引言92-93
• 7.2 材料和方法93-100
• 7.2.1 血液的收集93-94
• 7.2.2 人、雞、蛙、魚紅細胞PKC的激活94-95
• 7.2.3 人、雞、蛙、魚紅細胞變形性檢測95-96
• 7.2.4 人、雞、蛙、魚紅細胞楊氏模量檢測96-99
• 7.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析99-100
• 7.3 實驗結(jié)果100-105
• 7.3.1 PMA對人、雞、蛙、魚紅細胞形變能力的影響100-101
• 7.3.2 PMA對人、雞、蛙、魚紅細胞楊氏模量的影響101-105
• 7.4 分析討論105-107
• 7.5 本章小結(jié)107-108
• 8 PKC誘導人、雞、蛙、魚紅細胞蛋白 4.1 磷酸化的檢測及脊椎生物紅細胞蛋白 4.1 的氨基酸序列分析108-128
• 8.1 引言108-110
• 8.2 材料和方法110-120
• 8.2.1 紅細胞膜骨架蛋白Spectrin以及磷酸絲氨酸蛋白的免疫印跡分析110-112
• 8.2.2 紅細胞膜蛋白的提取112-113
• 8.2.3 紅細胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度膠）113-117
• 8.2.4 紅細胞膜蛋白Western Blot117-119
• 8.2.5 脊椎生物紅細胞蛋白 4.1 氨基酸序列分析119
• 8.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析119-120
• 8.3 實實驗結(jié)果120-125
• 8.3.1 紅細胞磷酸絲氨酸蛋白以及血影蛋白的免疫熒光染色結(jié)果120-121
• 8.3.2 紅細胞膜蛋白電泳121-122
• 8.3.3 紅細胞膜蛋白 4.1 磷酸化檢測122-123
• 8.3.4 紅細胞膜蛋白 4.1 氨基酸序列分析123-125
• 8.4 分析與討論125-126
• 8.5 本章小結(jié)126-128
• 9 結(jié)論與展望128-130
• 9.1 結(jié)論128-129
• 9.2 不足之處與后續(xù)工作展望129-130
• 致謝130-132
• 參考文獻132-146
• 附錄146-147
• A. 作者在攻讀學位期間發(fā)表的論文目錄146
• B. 參加科研項目情況146-147

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張云;王端順;張鴻卿;王瑞虹;薛紹白;;v-src,Ca~(2+),PKC和cAMP對3T3-tsLA90細胞間隙連接通訊的調(diào)節(jié)[J];北京師范大學學報(自然科學版);1992年02期

2 崔玉東;牛多形核白細胞(PMN)中P38 MAPK,PKC和PI3-K介導的NADPH氧化酶激活和吞噬作用(英文)[J];中國預防獸醫(yī)學報;2000年S1期

3 ;[J];;年期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 張彤彤;王征;梁建偉;魯海珍;韓亞玲;王明榮;;蛋白激酶PKCι蛋白表達升高與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

2 Si-Qiang REN;Jing-Zhi YAN;Xiao-Yan ZHANG;Yun-Fei BU;Wei-Wei PAN;Wen YAO;Tian TIAN;Wei LU;;PKCλ is critical in AMPA receptor phosphorylation and synaptic incorporation during LTP[A];中國神經(jīng)科學學會第十屆全國學術會議論文摘要集[C];2013年

3 夏婷;吳緒峰;陳惠禎;;卵巢癌中PKC和P-gp的表達及其臨床意義[A];全國子宮頸癌暨湖北省婦科腫瘤專業(yè)委員會第五次婦科腫瘤學術會議論文匯編[C];2006年

4 王思思;孫巍;楊世杰;;生物學靶標PKC在蒺藜皂苷抗心肌缺血中的作用[A];2008心血管藥理學術研討會論文匯編[C];2008年

5 馬大為;;代謝型谷氨酸受體和PKC有亞基選擇性的調(diào)節(jié)劑研究[A];生命科學與生物技術：中國科協(xié)第三屆青年學術年會論文集[C];1998年

6 王博石;劉曙光;汪曉敏;史志周;張彤彤;劉一臻;商利;張鈺;王明榮;;PKCι在食管癌中相互作用蛋白的篩選與鑒定[A];全國腫瘤流行病學和腫瘤病因?qū)W學術會議論文集[C];2011年

7 胡曉輝;鄭珍珍;盛麗琴;潘平雷;宋偉;周東;商慧芳;;佛波酯誘導的蛋白激酶C(PKC)活化不影響TorisnA亞細胞分布[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 唐福州;PKC誘導紅細胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細胞噬紅細胞作用[D];重慶大學;2015年

2 宋宗斌;PKCγ調(diào)控慢性嗎啡耐受的蛋白質(zhì)組學研究[D];中南大學;2012年

3 胡桂芹;甲基汞致腦發(fā)育損傷及PKC和CaN介導的細胞周期負向調(diào)控[D];吉林大學;2010年

4 李力卓;蛋白激酶C-α（PKC-α）在腎癌中與多藥耐藥相關性研究[D];中國醫(yī)科大學;2005年

5 彭鏡;PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信號通路調(diào)控TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細胞通透性增高的機制[D];中南大學;2011年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 朱鐘鳴;PKCδ抑制劑對脂多糖誘導大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞損傷的干預作用[D];安徽醫(yī)科大學;2006年

2 胡玉海;不同經(jīng)穴針刺對腦卒中偏癱痙攣狀態(tài)大鼠PKC表達影響的研究[D];黑龍江省中醫(yī)研究院;2012年

3 尹航;不同經(jīng)穴針刺對腦卒中偏癱痙攣狀態(tài)大鼠PKC水平影響的研究[D];黑龍江省中醫(yī)研究院;2011年

4 衛(wèi)瑋;活性氧與PKC在亞硒酸鈉誘導人急性早幼粒白血病細胞凋亡中的作用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

5 李軍;PKC-α及PKC-ε在腎癌及其周圍正常組織中表達的研究[D];中國醫(yī)科大學;2002年

6 李光艷;PI-3K、DGAT_2、PKC-ε在大鼠非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制的作用研究[D];瀘州醫(yī)學院;2010年

7 付正香;PKC在收縮調(diào)節(jié)骨骼肌細胞GLUT4轉(zhuǎn)位機制中的作用[D];天津醫(yī)科大學;2010年

  本文關鍵詞：PKC誘導紅細胞錨蛋白外翻誘發(fā)的巨噬細胞噬紅細胞作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：318201