本文關(guān)鍵詞：TALEN介導(dǎo)的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生產(chǎn)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是羊乳中引起嬰幼兒乳過(guò)敏癥的主要過(guò)敏原之一。目前多采用生物化學(xué)方法對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行加工處理以降低其致敏性,但并不能從根本上解決其致敏問(wèn)題。靶向基因編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展為從根本上徹底消除乳汁中的β-乳球蛋白提供了可能。研究表明,TALEN介導(dǎo)的基因打靶可以在生物基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行精確的基因插入或刪除。本研究通過(guò)構(gòu)建以山羊BLG基因第一外顯子為靶位點(diǎn)的TALENs表達(dá)載體及基因打靶載體,在山羊胎兒成纖維細(xì)胞中利用TALEN介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)對(duì)BLG基因進(jìn)行敲除,利用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)BLG基因單敲除奶山羊;并通過(guò)在山羊體細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)的基因打靶獲得BLG基因雙敲除奶山羊。研究?jī)?nèi)容如下:1.靶向山羊BLG基因TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter”篩選TALENs靶位點(diǎn),利用單元組裝法構(gòu)建TALEN表達(dá)載體,構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體,將TALEN表達(dá)載體與報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞驗(yàn)證其生物活性。結(jié)果顯示:以山羊BLG基因第一外顯子序列為靶位點(diǎn),利用單元組裝法構(gòu)建TALEN表達(dá)載體p TSBE1-R和p TRBE1-L,構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體p RFP-BE1-GFP,雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明單元組裝法構(gòu)建的TALENs表達(dá)載體可特異性識(shí)別并切割其對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)。2.山羊BLG基因打靶載體的構(gòu)建以西農(nóng)莎能奶山羊基因組DNA為模板分別克隆不同大小的同源臂序列,分別構(gòu)建3個(gè)靶向BLG基因的置換型基因敲除載體p BLG-neo、p BLG-neo-M和p BLG-puro。結(jié)果顯示:以ploxpⅡ?yàn)楣羌茌d體構(gòu)建的p BLG-neo和p BLG-neo-M均含有新霉素抗性篩選標(biāo)記,其中p BLG-neo的5’和3’同源臂大小分別為1.1 kb和5.3 kb;p BLG-neo-M的5’和3’同源臂大小分別為1.1 kb和1.3 kb。p BLG-puro含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性基因作為雙陽(yáng)性篩選標(biāo)記,其5’和3’同源臂大小均為1.0 kb。3.山羊胎兒成纖維細(xì)胞中BLG基因打靶效率的檢測(cè)將TALEN表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA或以其為模板體外轉(zhuǎn)錄制備的m RNAs電穿孔法轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞(goat fetal fibroblasts,GFFs),使用有限稀釋法獲取單細(xì)胞克隆,經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定檢測(cè)TALENs介導(dǎo)的非同源末端連接修復(fù)引起的BLG基因修飾效率;將基因打靶載體p BLG-neo和p BLG-neo-M分別轉(zhuǎn)染GFFs,經(jīng)藥物篩選后,使用PCR鑒定檢測(cè)自然發(fā)生的同源重組介導(dǎo)的基因打靶效率;將TALENs的DNA或m RNAs與p BLG-neo或p BLG-neo-M共轉(zhuǎn)GFFs,經(jīng)藥物篩選后,使用PCR鑒定檢測(cè)TALEN介導(dǎo)的基因打靶效率。結(jié)果顯示:將TALENs電轉(zhuǎn)染GFFs,有限稀釋法獲得303個(gè)單細(xì)胞克隆,經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定,并未發(fā)現(xiàn)BLG基因修飾突變體。僅轉(zhuǎn)染基因打靶載體至GFFs,共獲得G418抗性克隆1005個(gè),經(jīng)過(guò)PCR鑒定未發(fā)現(xiàn)基因打靶細(xì)胞。將TALENs與不同的打靶載體共轉(zhuǎn)GFFs,經(jīng)藥物篩選和PCR鑒定,均獲得了打靶載體中PGK-neo片段定點(diǎn)整合至山羊BLG基因座的細(xì)胞克隆;另外發(fā)現(xiàn),必須同時(shí)進(jìn)行5’端和3’端的PCR鑒定才能保證基因打靶鑒定的準(zhǔn)確性經(jīng)過(guò)兩輪5’端和3’端的PCR鑒定,TALENs DNA與p BLG-neo-M共轉(zhuǎn)GFFs獲得的598個(gè)G418抗性克隆中,有94個(gè)發(fā)生了基因打靶,效率為13.6%;TALENs m RNA與p BLG-neo-M共轉(zhuǎn)GFFs獲得的459個(gè)G418抗性克隆,有49個(gè)發(fā)生了基因打靶,效率為10.7%。另外發(fā)現(xiàn),將TALENs質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染GFFs,會(huì)發(fā)生TALENs表達(dá)載體在山羊基因組中的隨機(jī)整合。4.體細(xì)胞核移植生產(chǎn)BLG基因單敲除山羊以TALEN m RNAs介導(dǎo)的基因打靶細(xì)胞為核供體細(xì)胞進(jìn)行核移植和胚胎移植生產(chǎn)克隆羊,并對(duì)出生后代進(jìn)行PCR、測(cè)序及Southern blot鑒定。結(jié)果顯示:以BLG基因單敲除細(xì)胞為核供體共構(gòu)建克隆胚胎1128枚,出生并存活克隆羊7只,經(jīng)PCR、Southern blot鑒定,其均為BLG基因單敲除山羊;經(jīng)測(cè)序比對(duì)鑒定,BLG基因第一外顯子信號(hào)肽序列后的20 bp序列被刪除,置換為打靶載體p BLG-neo中1935 bp的外源基因。5.BLG基因雙敲除山羊的生產(chǎn)取BLG基因單敲除(BLG+/-)山羊耳組織分離得到BLG+/-成體成纖維細(xì)胞,以p BLG-puro為打靶載體,在BLG+/-細(xì)胞中進(jìn)行TALEN介導(dǎo)的二次基因打靶,經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選與PCR鑒定,檢測(cè)對(duì)BLG的另一等位基因的敲除效率;以TALENs m RNA介導(dǎo)的BLG基因雙敲除(BLG-/-)細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植及胚胎移植生產(chǎn)克隆羊,并對(duì)出生后代進(jìn)行PCR、測(cè)序及Southern blot鑒定。結(jié)果顯示:將TALENs質(zhì)粒DNA與打靶載體p BLG-puro共轉(zhuǎn)BLG+/-細(xì)胞,共獲得嘌呤霉素抗性克隆667個(gè),經(jīng)5’端和3’端PCR鑒定后,打靶陽(yáng)性克隆為39個(gè)(5.85%);將TALENs m RNA與打靶載體p BLG-puro共轉(zhuǎn)BLG+/-細(xì)胞,共獲得嘌呤霉素抗性克隆647個(gè),經(jīng)5’端和3’端PCR鑒定后,打靶陽(yáng)性克隆為33個(gè)(5.10%);對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行Southern blot鑒定,所有克隆均顯示為BLG基因雙等位基因發(fā)生打靶。共構(gòu)建克隆胚805個(gè),獲得克隆山羊3只,經(jīng)PCR、Southern blot鑒定,其均為BLG基因雙敲除山羊。綜上所述,本研究建立了利用TALEN介導(dǎo)的基因打靶在動(dòng)物體細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除的技術(shù)體系,并通過(guò)體細(xì)胞克隆分別獲得BLG基因單敲除奶山羊7只,BLG基因雙敲除奶山羊3只,為β-乳球蛋白敲除奶山羊的新品種培育提供了材料,為研究β-乳球蛋白功能以及以BLG基因座作為靶位點(diǎn)研制乳腺生物反應(yīng)器奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：TALEN β-乳球蛋白 奶山羊 基因打靶 同源重組
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S827
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-15
• 文獻(xiàn)綜述15-39
• 第一章 β-乳球蛋白研究進(jìn)展15-20
• 1.1 β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2 β-乳球蛋白的生物功能16-17
• 1.3 β-乳球蛋白致敏性研究及其解決方法17-20
• 1.3.1 β-乳球蛋白的致敏性17-18
• 1.3.2 β-乳球蛋白的致敏性的降低與消除18-20
• 第二章 人工核酸酶在家畜靶向基因組編輯研究中的應(yīng)用20-39
• 2.1 DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制20-25
• 2.1.1 非同源末端連接修復(fù)途徑20-21
• 2.1.2 同源重組修復(fù)途徑21-24
• 2.1.3 修復(fù)途徑的選擇調(diào)控24
• 2.1.4 雙鏈斷裂修復(fù)時(shí)NHEJ和HR的合作24-25
• 2.2 人工核酸內(nèi)切酶25-33
• 2.2.1 鋅指核酸酶25-27
• 2.2.2 類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶27-31
• 2.2.3 CRISPR/Cas931-33
• 2.3 人工核酸酶介導(dǎo)的NHEJ修復(fù)在家畜靶向基因組編輯中的應(yīng)用33-38
• 2.4 人工核酸酶介導(dǎo)的HR修復(fù)在家畜靶向基因組編輯中的應(yīng)用38-39
• 試驗(yàn)研究39-93
• 第三章 靶向山羊BLG基因的TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建39-50
• 3.1 試驗(yàn)材料39-40
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株39
• 3.1.2 主要試劑39-40
• 3.1.3 測(cè)試化驗(yàn)加工40
• 3.2 試驗(yàn)方法40-42
• 3.2.1 單元組裝法構(gòu)建TALENs表達(dá)載體40-41
• 3.2.2 TALENs的生物活性驗(yàn)證41-42
• 3.3 結(jié)果42-48
• 3.3.1 以山羊BLG基因?yàn)榘形稽c(diǎn)的TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建42-46
• 3.3.2 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證TALENs的生物活性46-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結(jié)49-50
• 第四章 山羊BLG基因打靶載體的構(gòu)建50-59
• 4.1 試驗(yàn)材料50-51
• 4.1.1 血液樣本50
• 4.1.2 菌株和質(zhì)粒50
• 4.1.3 主要試劑50-51
• 4.1.4 測(cè)試化驗(yàn)加工51
• 4.2 試驗(yàn)方法51-53
• 4.2.1 山羊BLG基因打靶載體pBLG-neo-M的構(gòu)建51-52
• 4.2.2 山羊BLG基因打靶載體pBLG-neo的構(gòu)建52-53
• 4.2.3 山羊BLG基因打靶載體pBLG-puro的構(gòu)建53
• 4.3 結(jié)果53-57
• 4.3.1 基因打靶載體pBLG-neo和pBLG-neo-M的構(gòu)建53-55
• 4.3.2 基因打靶載體pBLG-puro的構(gòu)建55-57
• 4.4 討論57-58
• 4.5 小結(jié)58-59
• 第五章 山羊體細(xì)胞中TALEN介導(dǎo)的基因打靶效率檢測(cè)59-73
• 5.1 試驗(yàn)材料59-60
• 5.1.1 動(dòng)物組織59
• 5.1.2 主要試劑59-60
• 5.1.3 測(cè)試化驗(yàn)加工60
• 5.2 試驗(yàn)方法60-65
• 5.2.1 西農(nóng)莎能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與性別鑒定60-61
• 5.2.2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞中TALEN介導(dǎo)的NHEJ引起的BLG基因修飾61-62
• 5.2.3 山羊胎兒成纖維細(xì)胞中TALEN介導(dǎo)的山羊BLG基因打靶效率62-65
• 5.3 結(jié)果65-69
• 5.3.1 山羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與性別鑒定65
• 5.3.2 山羊胎兒成纖維細(xì)胞中山TALEN介導(dǎo)的NHEJ引起的BLG基因修飾檢測(cè)65-66
• 5.3.3 山羊胎兒成纖維細(xì)胞中TALENs介導(dǎo)的BLG基因打靶效率檢測(cè)66-69
• 5.4 討論69-71
• 5.5 小結(jié)71-73
• 第六章 體細(xì)胞核移植生產(chǎn)BLG基因單敲除奶山羊73-82
• 6.1 試驗(yàn)材料73-74
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物73
• 6.1.2 主要試劑73-74
• 6.1.3 測(cè)試化驗(yàn)加工74
• 6.2 試驗(yàn)方法74-76
• 6.2.1 體細(xì)胞核移植及胚胎移植74-75
• 6.2.2 轉(zhuǎn)基因山羊PCR和Southern鑒定75-76
• 6.3 結(jié)果76-79
• 6.3.1 基因打靶細(xì)胞的體細(xì)胞核移植及效率檢測(cè)76-78
• 6.3.2 轉(zhuǎn)基因山羊PCR和Southern鑒定78-79
• 6.4 討論79-81
• 6.5 小結(jié)81-82
• 第七章BLG基因雙敲除奶山羊的生產(chǎn)82-93
• 7.1 試驗(yàn)材料82-83
• 7.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物82
• 7.1.2 質(zhì)粒和菌株82
• 7.1.3 主要試劑82-83
• 7.1.4 測(cè)試化驗(yàn)加工83
• 7.2 試驗(yàn)方法83-85
• 7.2.1 BLG基因單敲除成體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)83
• 7.2.2 二次基因打靶效率的檢測(cè)83-84
• 7.2.3 BLG基因雙敲除山羊的生產(chǎn)及鑒定84-85
• 7.3 結(jié)果85-90
• 7.3.1 BLG基因單敲除成體成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)85
• 7.3.2 二次基因打靶效率的檢測(cè)85-88
• 7.3.3 BLG基因雙敲除山羊的生產(chǎn)88-90
• 7.4 討論90-92
• 7.5 小結(jié)92-93
• 結(jié)論93-94
• 創(chuàng)新之處與進(jìn)一步研究的課題94-95
• 參考文獻(xiàn)95-112
• 附錄 主要儀器112-114
• 縮略詞114-115
• 致謝115-116
• 作者簡(jiǎn)介116

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 BAO Lei;CHEN HaiDe;JONG UiMyong;RIM CholHo;LI WenLing;LIN XiJuan;ZHANG Dan;LUO Qiong;CUI Chun;HUANG HeFeng;ZHANG Yan;XIAO Lei;FU ZhiXin;;Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

2 曹隨忠;岳成鶴;李西睿;馮沖;龍川;潘登科;;鋅指核酸酶技術(shù)制備肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除的五指山小型豬成纖維細(xì)胞[J];遺傳;2013年06期

  本文關(guān)鍵詞：TALEN介導(dǎo)的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生產(chǎn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：317898