本文關鍵詞：豬股骨降血壓肽分離純化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究采用本實驗室前期研究的以豬股骨酶解的酶解液為原料,分別利用超濾、凝膠層析、離子交換層析、制備型反相高效液相色譜分離純化技術從酶解液中分離純化豬股骨降血壓肽。采用0.22μm、0.45μm兩種孔徑濾膜過濾豬股骨酶解液,再利用截留分子量為5kD的超濾離心管對過濾后的酶解液進行超濾,比較兩種濾膜過濾的酶解液超濾分離后濾液的色值、澄清度、蛋白得率及ACE(血管緊張素轉換酶)抑制活性。研究顯示：0.22μm微孔濾膜處理的酶解液超濾后的色值、澄清度效果好于0.45gm微孔濾膜,兩者超濾后分子量段的ACE抑制率差異不顯著,蛋白得率前者較低。將豬股骨酶解液超濾分離后5kD的酶解濾液(其IC50值為1.362mg/mL)進行凝膠層析分離,研究了洗脫液、流速、上樣量三個因素對豬股骨降血壓肽分離純化效果的影響。結果表明：以去離子水為洗脫液,控制進出流速為0.6mL/min,上樣量為1%時,能夠得到最佳分離效果,其最高活性組分IC50值達到0.4016mg/mL。豬股骨酶解液經超濾、凝膠層析初步分離后,為了得到更高活性且純度更高的降血壓肽,采用離子交換層析對凝膠層析分離后的高活性組分進一步分離。通過對洗脫液pH、離子強度、流速三個因素進行研究,確定了最佳分離條件：以pH=6.0、0.05mol/L磷酸鹽緩沖液為A液、B液為含1mol/LNaCl的pH=6.0. 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,洗脫流速為0.8mL/min。結果顯示：離子交換層析分離得3個組分,其中組分1的活性最高,其IC50值為0.1012mg/mL;離子交換層析之后得到的豬股骨降血壓肽溶液含有大量的鹽類,再利用凝膠層析將組分1進行脫鹽,其峰2的IC50值達到0.0836mg/mL,脫鹽率達到86.60%+0.5%。豬股骨酶解液經超濾、凝膠層析、離子交換層析分離后,為了進一步純化豬股骨降血壓肽,采用制備型反相高效液相色譜(RP-HPLC)對離子交換層析分離后的高活性組分進一步分離。通過對洗脫條件的優(yōu)化,確定了最佳分離條件：0-5min 0-80%A;5-8min 80-100%A;8-15min 80-60%A;15-20min 60-20%A。結果顯示：第一步RP-HPLC分離得到三個組分,其中峰Z2的活性最高,其IC50值為0.0437mg/mL;再將組分Z2進行第二步RP-HPLC分離,其峰Z21(記為組分H)的IC50值達到0.0352ms/ml,經純度鑒定后,組分H的純度為96.7%。通過分析組分H的氨基酸組成以及LC-MS的分離鑒定,其含有6種氨基酸(Glu,Ala,Val,Leu,PHe,Pro),其分子量為764.8D。
【關鍵詞】：豬股骨酶解液 降血壓肽 凝膠層析 離子交換層析 半抑制濃度
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ464.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-23
• 1.1 骨資源概況11-12
• 1.1.1 畜禽骨的營養(yǎng)價值11
• 1.1.2 骨資源利用11-12
• 1.2 降血壓肽與高血壓12-14
• 1.2.1 高血壓概況12
• 1.2.2 高血壓的危害及治療12
• 1.2.3 血管緊張素轉換酶的概述12-13
• 1.2.4 ACE與高血壓的關系13
• 1.2.5 降血壓肽的概況13
• 1.2.6 降血壓肽優(yōu)勢13-14
• 1.3 降血壓肽分離背景14
• 1.4 國內外降血壓肽的分離純化研究現(xiàn)狀14-20
• 1.4.1 超濾(UF)分離14-15
• 1.4.2 大孔吸附樹脂15
• 1.4.3 凝膠層析(GPC)15-16
• 1.4.4 離子交換層析(IEC)16-17
• 1.4.5 反相高效液相色譜(RP-HPLC)17-18
• 1.4.6 電泳法18
• 1.4.7 降血壓活性肽序列研究18-19
• 1.4.8 降血壓肽結構與功能的關系19-20
• 1.5 降血壓肽活性檢測方法研究現(xiàn)狀20-21
• 1.5.1 體外檢測20-21
• 1.5.2 體內檢測21
• 1.6 本研究的目的與意義21-22
• 1.7 試驗研究目標與內容22-23
• 2 材料與方法23-33
• 2.1 實驗試劑與材料23
• 2.2 儀器設備23
• 2.3 方法23-24
• 2.3.1 豬股骨的前處理23-24
• 2.3.2 豬股骨降血壓肽的制備24
• 2.3.3 酶解制備豬股骨降血壓肽的工藝條件24
• 2.4 降血壓肽的分離純化24-30
• 2.4.1 超濾分級24-25
• 2.4.2 凝膠層析分離純化25-26
• 2.4.3 離子交換層析26-27
• 2.4.4 脫鹽27-28
• 2.4.5 制備型反相高效液相色譜分離純化28-29
• 2.4.6 LC-MS鑒定29-30
• 2.5 指標的測定30-33
• 2.5.1 ACE抑制率的測定30-31
• 2.5.2 IC_(50)值測定方法31
• 2.5.3 蛋白質含量測定31-32
• 2.5.4 酶活力測定32-33
• 2.5.5 色值測定33
• 2.5.6 澄清度測定33
• 2.5.7 蛋白質濃度的測定33
• 2.5.8 數據統(tǒng)計分析33
• 3 結果與分析33-47
• 3.1 豬股骨蛋白質含量33
• 3.2 蛋白酶活力測定33
• 3.3 微孔濾膜過濾的影響33-34
• 3.4 超濾34
• 3.5 凝膠層析法對分離效果的影響34-38
• 3.5.1 不同洗脫液對分離效果的影響34-35
• 3.5.2 不同流速對分離效果的影響35-37
• 3.5.3 不同上樣量對分離效果的影響37-38
• 3.5.4 確定洗脫條件38
• 3.6 離子交換層析分離38-42
• 3.6.1 不同pH洗脫液對分離效果的影響39-40
• 3.6.2 不同離子強度對分離效果的影響40-41
• 3.6.3 不同洗脫流速對分離效果的影響41-42
• 3.6.4 確定最佳分離條件42
• 3.7 脫鹽42-43
• 3.8 制備型RP-HPLC分離降血壓肽43-46
• 3.8.1 兩步反相高效液相分離43-45
• 3.8.2 純度鑒定45
• 3.8.3 氨基酸成分分析45-46
• 3.9 LC-MS鑒定46-47
• 4 討論與結論47-49
• 4.1 討論47-48
• 4.1.1 關于超濾47
• 4.1.2 關于凝膠層析47
• 4.1.3 關于離子交換層析47-48
• 4.1.4 關于制備型反相高效液相色譜48
• 4.2 結論48-49
• 5 問題與展望49-50
• 參考文獻50-58
• 致謝58-59
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章59

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