發(fā)布時(shí)間：2025-05-11 03:21

　　溶菌酶能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁中β-1,4糖苷鍵,破壞細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)構(gòu),是一種安全性高的藥品、飼料食品添加劑。市場(chǎng)上銷售的溶菌酶主要是從雞蛋清中提取。相比于雞溶菌酶,人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)具有生物活性高、穩(wěn)定性好,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。受限于原料來源、提純精制成本等因素,人源溶菌酶制備量較少,不能滿足需求。本論文通過共表達(dá)分子伴侶Kar2p、ERO1p、轉(zhuǎn)錄因子Hac1p及優(yōu)化基因劑量,研究其對(duì)畢赤酵母KM71菌株表達(dá)人溶菌酶水平的影響,期望得到高效表達(dá)人溶菌酶的畢赤酵母基因工程菌株。(1)根據(jù)GenBank中Kar2p、ERO1p和Hac1p基因序列,設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建重組載體pG418-Kar2p、pG418-ERO1p和p9K-Hac1p。采用電擊轉(zhuǎn)化法,將構(gòu)建的重組載體整合于含人溶菌酶基因的重組酵母菌株KM71-pPIC-hLYZ-3基因組中,在含G418的YPDS平板上篩選得到共表達(dá)分子伴侶Kar2p、ERO1p和人溶菌酶的工程菌株 KM71-pPIC-hLYZ-Kar2p-5、KM71-pPIC-hLYZ-ERO1p-7,以及共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hac1p和人溶菌酶...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 溶菌酶概述
        1.1.1 溶菌酶
        1.1.2 溶菌酶應(yīng)用
        1.1.3 人源溶菌酶研究意義及現(xiàn)狀
    1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)
        1.2.1 畢赤酵母表達(dá)載體
        1.2.2 畢赤酵母表達(dá)宿主菌
        1.2.3 提高畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的策略
    1.3 本課題研究研究?jī)?nèi)容
2 共表達(dá)Kar2p、ERO1p和Hac1p對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 引物
        2.1.3 試劑及主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基及試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 質(zhì)粒提取
        2.2.2 PCR產(chǎn)物純化
        2.2.3 酶切DNA片段回收
        2.2.4 酵母基因組提取
        2.2.5 大腸桿菌DH5a感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.6 共表達(dá)分子伴侶Kar2p、ERO1p重組載體的構(gòu)建及鑒定
        2.2.7 共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Hac1p重組載體的構(gòu)建及鑒定
        2.2.8 工程菌株構(gòu)建
        2.2.9 共表達(dá)Kar2p、ERO1p和Hac1p的工程菌株搖瓶發(fā)酵
        2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.11 重組菌株生長(zhǎng)曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測(cè)定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 重組載體的構(gòu)建及鑒定
        2.3.2 共表達(dá)Kar2p、ERO1p及Hac1p的重組菌株構(gòu)建
        2.3.3 共表達(dá)Kar2p、ERO1p和Hac1p對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
        2.3.4 討論
    2.4 本章小結(jié)
3 基因劑量對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
    3.1 材料
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 試劑及主要儀器
        3.1.4 培養(yǎng)基及試劑
    3.2 方法
        3.2.1 多拷貝串聯(lián)載體的構(gòu)建及鑒定
        3.2.2 工程菌株構(gòu)建
        3.2.3 定量PCR鑒定工程菌株hly基因拷貝數(shù)
        3.2.4 工程菌株搖瓶發(fā)酵
        3.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        3.2.6 重組菌株生長(zhǎng)曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測(cè)定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 多拷貝串聯(lián)載體的構(gòu)建及鑒定
        3.3.2 攜帶不同hly基因拷貝數(shù)的工程菌株構(gòu)建
        3.3.3 定量PCR鑒定工程菌株hly基因拷貝數(shù)
        3.3.4 基因劑量對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
        3.3.5 討論
    3.4 本章小結(jié)
4 共表達(dá)Hac1p對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
    4.1 材料
        4.1.1 菌株及質(zhì)粒
        4.1.2 引物
        4.1.3 試劑及主要儀器
        4.1.4 培養(yǎng)基及試劑
    4.2 方法
        4.2.1 工程菌株構(gòu)建
        4.2.2 共表達(dá)Hac1p的工程菌株搖瓶發(fā)酵
        4.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        4.2.4 重組菌株生長(zhǎng)曲線、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的測(cè)定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 工程菌株構(gòu)建
        4.3.2 共表達(dá)Hac1p對(duì)hLYZ表達(dá)的影響
        4.3.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號(hào)：4044768