采用Piscidin基因串聯(lián)表達(dá)的方案,通過(guò)Eco31Ⅰ限制性內(nèi)切酶定向連接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin (PSP)串聯(lián)基因.以畢赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表達(dá)載體pPICZαA構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-PSP,轉(zhuǎn)化入畢赤酵母SMD1168菌株中.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行多拷貝克隆篩選,實(shí)現(xiàn)了PSP重組串聯(lián)肽的誘導(dǎo)表達(dá)和純化,并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行初步鑒定,為piscidin抗菌肽的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

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【部分圖文】：

圖1 PSP串聯(lián)基因設(shè)計(jì)

P.crocea-S.ocellatus-piscidin(PSP）串聯(lián)基因設(shè)計(jì)如圖1所示：由2個(gè)PC-piscidin基因、2個(gè)SO-piscidin基因和3個(gè)連接肽基因（linkergene，序列為5′-GGTTCTCCAGGTTCCGGT-3′）組成；串聯(lián)基因3′-端添加....

圖2 pPICZαA-PSP質(zhì)粒PCR檢測(cè)（a）與雙酶切驗(yàn)證（b)

使用5′-AOX和3′-AOX引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得約800bp的目的擴(kuò)增條帶（圖2(a））；再使用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切處理pPICZαA-PSP質(zhì)粒，如圖2(b）所示，可得358bp的目的片段與3500bp的載體條帶，證實(shí)插入表達(dá)載體的片段與設(shè)計(jì)合成基因一致．....

圖3 陽(yáng)性克隆篩選

pPICZαA-PSP及pPICZαA質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ線性化后，電轉(zhuǎn)化入SMD1168菌株，使用5′-AOX、3′-AOX、PC1、SO8引物交替組合進(jìn)行PCR，篩選陽(yáng)性克隆．圖3結(jié)果顯示各條帶大小均符合設(shè)計(jì)理論值，表明目的片段已正確整合進(jìn)酵母基因組中．2.3多拷貝重組菌株的篩選

圖4 GAP基因和PSP串聯(lián)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

GAP基因和PSP串聯(lián)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程見(jiàn)圖4．將實(shí)驗(yàn)所得各陽(yáng)性菌株的Ct值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，求出所檢測(cè)的DNA樣品中PSP串聯(lián)基因拷貝數(shù)與GAP基因拷貝數(shù)，兩者比值即為PSP串聯(lián)基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示第12號(hào)菌株在基因組中存在5個(gè)拷貝的PSP基因（....

本文編號(hào)：4043012