本研究在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的敲除α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT8)基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞株(FUT8-/--CHO-S)基礎(chǔ)上,建立了穩(wěn)定表達(dá)IgG1型抗HER2單克隆抗體的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。以曲妥珠單抗為模式蛋白,構(gòu)建了帶有嘌呤霉素抗性基因的表達(dá)載體pIRES-HC和pIRES-LC,并用電穿孔法共轉(zhuǎn)染入FUT8-/--CHO-S細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素加壓培養(yǎng)、Dot Blot和WesternBlot等檢測(cè)方法,經(jīng)過(guò)兩輪有限稀釋篩選出了高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。該細(xì)胞株在批次培養(yǎng)(Batch)中最高生長(zhǎng)密度達(dá)每毫升6.05×106個(gè),抗體產(chǎn)量為168 mg/L。在補(bǔ)料培養(yǎng)(Fed-Batch)中,通過(guò)補(bǔ)料CHO Feed4的添加,最高生長(zhǎng)密度提高到每毫升17.1×106個(gè),抗體產(chǎn)量達(dá)到437 mg/L,試驗(yàn)結(jié)果表明改造的FUT8-/--CHO-S細(xì)胞株具有開發(fā)成工業(yè)細(xì)胞株的潛力。

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【部分圖文】：

圖2M-Marker；1-轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清；2-曲妥珠單抗(陽(yáng)性對(duì)照，25ng/μl)；3-未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清(陰性對(duì)照)

stableandhighexpressioncellclonehigherproductionbyapplyingaFed-Batchstrategyα-1,6-fucosyltransferase(FUT8)geneknockoutCHO-Scellsclonalcellis....

圖3檢測(cè)(陽(yáng)性對(duì)照-曲妥珠單抗，上樣量2μl)，B：挑選的單克隆細(xì)胞抗體表達(dá)的WesternBlot檢測(cè)M-Marker；1-曲妥珠單抗(25ng/μl)；2～37-36株單克隆細(xì)

養(yǎng)，取等量細(xì)胞上清用WesternBlot進(jìn)一步檢測(cè)蛋白表達(dá)情況(圖3B)，篩選出高表達(dá)的初始細(xì)胞株后，用有限稀釋法進(jìn)行第二輪篩眩重復(fù)上述篩選步驟，并對(duì)得到的高表達(dá)亞克隆細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化培養(yǎng)，得到最終的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照M1234567....

圖4A：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(n=3)，B：細(xì)胞上清ProteinA純化的SDS-PAGE檢測(cè)M-Marker；1-細(xì)胞上清；2-流穿液；3、4、6-洗脫得到的蛋白樣品；5-曲妥珠單抗

－補(bǔ)料EfficientFeedA；○－補(bǔ)roporationsfectionselectionwithpuromycin3weekswithnA8060402010080604020012345678細(xì)胞活率/%活細(xì)胞密度/×10個(gè)5-活細(xì)胞密度；-細(xì)胞活率培養(yǎng)時(shí)間/d非還原還....

本文編號(hào)：4039397