發(fā)布時間：2023-05-10 06:11

　　植物進行遺傳轉(zhuǎn)化時,選擇標記是不可或缺的重要一環(huán)。目前,植物轉(zhuǎn)化常用的選擇標記主要有兩大類——抗生素抗性基因和抗除草劑基因,但現(xiàn)在由它們引起的生物安全性擔憂正日趨嚴重,所以開發(fā)一種新型且安全的選擇標記越來越被重視。亞磷酸鹽脫氫酶(phosphite dehydrogenase,PTDH)是一種依賴于NAD⁺、將亞磷酸鹽(Phi)氧化為正磷酸鹽(Pi)的酶。Phi不能被植物直接利用,相反對植物具有毒害作用�；诖颂匦�,目前利用Phi/PTDH組合已建立起一套新型多用途且有廣泛應用前景的植物轉(zhuǎn)化顯性選擇標記/植物磷利用/雜草控制系統(tǒng)。為了打破這套技術(shù)系統(tǒng)的國際專利壁壘,其關(guān)鍵點就是鑒定出PTDH的功能替代。由于大腸桿菌堿性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase,BAP)也具有將Phi氧化為Pi的活性且無輔酶依賴性,因此本工作試圖通過將它的基因EcBAP(即phoA)轉(zhuǎn)入植物中并以Phi作為選擇劑,驗證它能否頂替PTDH從而建立起Phi/BAP基礎(chǔ)上的類似系統(tǒng)。取得的主要結(jié)果如下:(1)EcBAP的基因克隆及其表達載體的構(gòu)建首先從大腸桿菌D...

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第1章 引言
    1.1 文獻綜述
        1.1.1 目前植物遺傳轉(zhuǎn)化選擇標記概述
        1.1.2 基于亞磷酸鹽/亞磷酸鹽脫氫酶的遺傳轉(zhuǎn)化和抗除草劑系統(tǒng)
            1.1.2.1 當前植物利用磷的主要問題
            1.1.2.2 亞磷酸鹽的特性
            1.1.2.3 亞磷酸鹽脫氫酶的生物學特性
            1.1.2.4 亞磷酸鹽脫氫酶的應用
    1.2 本論文的研究目的及意義
第2章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 試劑和工具酶
            2.1.2.1 試劑
            2.1.2.2 工具酶
        2.1.3 實驗所用試劑的配置
        2.1.4 實驗所用引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 植物表達載體的構(gòu)建
            2.2.1.1 Escherichia coli基因組DNA的提取
            2.2.1.2 核酸瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.1.3 EcBAP基因的擴增
            2.2.1.4 植物載體的構(gòu)建
            2.2.1.5 菌落PCR鑒定陽性克隆
            2.2.1.6 重組質(zhì)粒的提取和測序
        2.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)
            2.2.2.1 農(nóng)桿菌(LBA4404)感受態(tài)的制備
            2.2.2.2 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌(LBA4404)及菌落陽性鑒定
            2.2.2.3 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌(LBA4404)煙草轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)
            2.2.2.4 煙草葉盤轉(zhuǎn)化法及轉(zhuǎn)基因煙草的無菌培養(yǎng)
            2.2.2.5 EcBAP轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的鑒定
            2.2.2.6 EcBAP轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株RT-PCR
            2.2.2.7 EcBAP陽性轉(zhuǎn)基因煙草Phi脅迫下的葉片再生
            2.2.2.8 EcBAP轉(zhuǎn)基因煙草子代的Phi抗性分析
        2.2.3 原核表達載體的構(gòu)建及蛋白表達酶活分析
            2.2.3.1 基因的擴增
            2.2.3.2 原核表達載體pET(EcBAP)的構(gòu)建
            2.2.3.3 菌落PCR鑒定陽性克隆
            2.2.3.4 重組質(zhì)粒的提取和測序
        2.2.4 蛋白表達及酶活分析
            2.2.4.1 表達載體轉(zhuǎn)BL21(DE3)
            2.2.4.2 蛋白的誘導表達
            2.2.4.3 SDS-PAGE
            2.2.4.4 EcBAP蛋白活性膠跑膠
            2.2.4.5 分光光度法測蛋白EcBAP酶活
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 pBI(EcBAP)植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
        3.1.1 EcBAP基因的擴增
        3.1.2 PCR產(chǎn)物EcBAP、載體pBI121的酶切及連接
        3.1.3 pBI(EcBAP)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404
    3.2 基于卡那霉素篩選的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化煙草
    3.3 卡那霉素抗性pBI(EcBAP)轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株的鑒定
    3.4 EcBAP(Kan)轉(zhuǎn)基因煙草葉片在含不同濃度Phi的缺PiMS培養(yǎng)基上的再生
    3.5 EcBAP(Kan)轉(zhuǎn)基因煙草葉片在含不同濃度Phi的正常MS培養(yǎng)基上的再生
    3.6 以Phi作為篩選劑進行農(nóng)桿菌侵染煙草轉(zhuǎn)化
    3.7 Phi抗性Ec BAP轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定
    3.8 2.5mM Phi篩選下EcBAP轉(zhuǎn)基因煙草的基因表達分析
    3.9 亞磷酸鹽脅迫和雜草控制實驗
        3.9.1 亞磷酸鹽脅迫水平平板實驗
        3.9.2 亞磷酸鹽脅迫垂直平板實驗
        3.9.3 雜草控制系統(tǒng)實驗
    3.10 EcBAP基因在大腸桿菌中的重組表達及其酶活分析
        3.10.1 原核表達載體pET(EcBAP)的構(gòu)建
        3.10.2 pET(EcBAP)的蛋白表達
        3.10.3 重組蛋白EcBAP的純化及酶活測定
第4章 總結(jié)與討論
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文和研究成果
致謝



本文編號：3813198