玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是鐮刀菌屬產(chǎn)生的類雌激素毒素,可對(duì)人體及家禽造成生殖毒性、遺傳毒性、免疫毒性等多種毒性,在農(nóng)作物的生長、收獲、加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過程中都可能受其污染,可在全世界范圍內(nèi)對(duì)人體健康造成威脅。針對(duì)此現(xiàn)狀,本研究從生物脫毒法著手對(duì)ZEN的脫毒降解進(jìn)行研究,現(xiàn)有資料表明,嗜酸乳桿菌是乳酸菌中被廣泛研究的益生菌之一,其在腸道中較強(qiáng)的黏附能力和較高的耐酸耐膽鹽能力,具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群環(huán)境、提高機(jī)體免疫力、抑制致病菌等多重益生特性,在乳品、飲料、飼料等食品領(lǐng)域中均得到了開發(fā)應(yīng)用,在醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用中也有所貢獻(xiàn),基于此,本實(shí)驗(yàn)選定嗜酸乳桿菌通過基因克隆手段使其獲得生物法降解ZEN的能力。本論文以實(shí)驗(yàn)室已有的質(zhì)粒p PIC9K-Oxa為模板,設(shè)計(jì)引物P1、P2,擴(kuò)增從不動(dòng)桿菌SM04分離的ZEN降解酶Oxa基因插入乳桿菌穿梭載體p MG36e中,化學(xué)法轉(zhuǎn)入E.coli JM109構(gòu)建重組質(zhì)粒p MG36e-Oxa,再將重組質(zhì)�？寺〉绞人崛闂U菌ATCC4356中,通過重組菌的培養(yǎng)表達(dá)獲得重組蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳和ZEN降解實(shí)驗(yàn)對(duì)重組蛋白Oxa的表達(dá)和降解活性進(jìn)... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

第二章重組質(zhì)粒pMG36e-Oxa構(gòu)建17按2.2.4中的擴(kuò)增條件進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。將電泳結(jié)果中成功擴(kuò)增出目的基因條帶的陽性轉(zhuǎn)化子分別接種到50mL含抗生素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫180r/min搖床過夜培養(yǎng)，并將培養(yǎng)物按照本章2.2.2的方法提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切，使用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果進(jìn)行初步鑒定，同時(shí)將陽性重組子菌體培養(yǎng)液送至生物工程（上海）有限公司提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序引物如表2-3所示：表2-3引物Table.2-3Primers名稱序列長度F15’-GGATTTTTGTGAGCTTGGAC-3’20bpF25’-ACCATTTGACTTTGAACCTC-3’20bp2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2.4.1目的基因擴(kuò)增及載體提取Oxa基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示所得產(chǎn)物條帶片段約為820bp，與引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增后所得產(chǎn)物長度（820bp）相符（如圖2-1所示）。將從E.coliDH5α中提取的質(zhì)粒pMG36e使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，成功提取到所需載體（如圖2-2所示）。M11M22M1.2000DNAMarkerM2.5000DNAMarker1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.質(zhì)粒pMG36e條帶圖2-1目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖圖2-2提取質(zhì)粒pMG36e條帶Fig.2-1ElectrophoresisanalysisFig.2-2Electrophoresisanalysis2.4.2重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定將雙酶切后回收的載體片段VectorDNA（如圖2-3所示）與目的基因片段InsertDNA進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG36e-Oxa，通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌2000100075050050003000目的基因pMG36e

華南理工大學(xué)工程碩士學(xué)位論文18后通過菌落PCR進(jìn)行重組子挑選，菌落PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-4所示，從含抗生素的LB平板上所選的兩個(gè)單菌落均成功擴(kuò)增出了與目的基因（820bp）片段大小一致的條帶。將PCR擴(kuò)增成功的轉(zhuǎn)化子單菌落接種至含有抗生素抗性標(biāo)記的LB液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2-5所示，雙酶切產(chǎn)物中含有與載體片段（3.6kb）大小相一致的條帶和與目的基因（820bp）片段大小相一致的條帶，初步證明重組質(zhì)粒pMG36e-Oxa成功構(gòu)建并導(dǎo)入至E.coliJM109中。M31234M3.23130DNAMaker1.質(zhì)粒pMG36e2.質(zhì)粒pMG36eSmaI單酶切3.質(zhì)粒pMG36eHindШ單酶切4.質(zhì)粒pMG36eSmaI、HindШ雙酶切條帶圖2-3質(zhì)粒pMG36e雙酶切電泳結(jié)果Fig.2-3ElectrophoresisanalysisM212M23M2.5000DNAMarker1,2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶3.重組質(zhì)粒雙酶切條帶圖2-4菌落PCR電泳圖圖2-5重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2-4ElectrophoresisanalysisFig.2-5Electrophoresisanalysis同時(shí)，經(jīng)生物工程（上海）有限公司的質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果（如圖2-6所示），從102bp開始至887bp結(jié)束，為目的基因Oxa的基因序列，而102bp以前的序列及887bp以后的序列分別為兩個(gè)酶切位點(diǎn)序列及相對(duì)應(yīng)的載體連接序列，根43612322202750003000750pMG36e目的基因目的基因雙酶切片段

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3338360