同型融合和蛋白質(zhì)分選復(fù)合體（HOPS）由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41這6種蛋白組成,能夠通過膜融合機制來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的膜泡運輸。已有研究表明其可以作為融合因子來促進自噬體與溶酶體膜融合過程。為在體外確定HOPS復(fù)合體與自噬性SNARE蛋白STX17是否具有直接相互作用,首先利用PCR技術(shù)從已有質(zhì)粒中擴增得到6種基因的編碼序列,將其連接至pGEX 4T-1-GST或pET-His-NusA原核表達載體上,經(jīng)菌落PCR初步鑒定和DNA測序無誤后成功構(gòu)建6種原核表達重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）;利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂與鎳柱對重組蛋白進行純化,煙草蝕紋病毒（TEV）蛋白酶酶切掉GST或His-NusA標簽,得到分子量約為105 kDa的HA-VPS11蛋白、97 kDa的Flag-VPS16蛋白、108 kDa的HA-VPS18蛋白、70 kDa的Flag-VPS33蛋白、97 k Da的HA-VPS39蛋白和98 kDa的Flag-VPS41蛋白;通過體外GST pull-down技術(shù)對6種蛋白的功能進行驗證,證實自噬性SNARE蛋白S... 

【文章來源】：生物工程學(xué)報. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

VPS18、VPS39和VPS11基因的PCR擴增

VPS16、VPS41和VPS33基因的PCR擴增

經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting方法檢測得出以下結(jié)果：利用鎳柱親和層析方式成功純化得到分子量在105 kDa左右的HA-VPS11重組蛋白、108 kDa左右的HA-VPS18重組蛋白及97 kDa左右的HA-VPS39重組蛋白(圖7)；利用谷胱甘肽親和層析方式成功純化得到分子量在97 kDa左右的Flag-VPS16重組蛋白、70 kDa左右的Flag-VPS33重組蛋白及98 kDa左右的Flag-VPS41重組蛋白(圖8)。圖4 pGEX 4T-1-GST載體圖譜

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]人ATG4B的表達及蛋白純化和鑒定[J]. 黃蓉,徐小潔,梁迎春,張立,王濤,周麗英,杜楠,葉棋濃.  細胞與分子免疫學(xué)雜志. 2015(02)
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本文編號：3338267