傳染病是一類(lèi)由各種病原體引起的具有傳染性和流行性的疾病。病毒和細(xì)菌是引起多數(shù)傳染病的主要病原體�；赥aq Man探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q PCR）常用于病毒和細(xì)菌的診斷或定量。具有高變異特性的病毒（尤其是RNA病毒）限制q PCR擴(kuò)增的檢測(cè)能力和效率。此外,隨著細(xì)菌對(duì)臨床常用抗生素的耐藥性日益增加,多重耐藥細(xì)菌不斷增多,傳統(tǒng)q PCR難以實(shí)現(xiàn)單管對(duì)多個(gè)耐藥基因同時(shí)檢測(cè)�；谏鲜鰡�(wèn)題,本研究分別建立了兩種q PCR檢測(cè)方法,主要研究?jī)?nèi)容如下:（1）RSV耐錯(cuò)配型q PCR檢測(cè)方法的構(gòu)建呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是導(dǎo)致嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病毒病原體之一。RSV感染的及時(shí)診斷,對(duì)治療和預(yù)防RSV感染很重要。本部分基于高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶特性,建立了一種新型耐錯(cuò)配的q PCR,并應(yīng)用于RSV的檢測(cè),與傳統(tǒng)q PCR相比,該法對(duì)突變體的擴(kuò)增效率更高并具有良好的靈敏度和特異性,檢測(cè)限可達(dá)1.8 PFU/m L。該法對(duì)80%RSV陽(yáng)性樣品檢測(cè)的Ct值相對(duì)較低,通過(guò)對(duì)這些樣本進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),樣本與引物3’端有錯(cuò)配,證明... 

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qPCR染料法原理

上海大學(xué)碩士學(xué)位論文9圖1.2TaqMan探針原理Figure1.2PrincipleofTaqManprobe②TaqMan探針（MGB）TaqMan-MGB探針是將水解探針的淬滅集團(tuán)替換成了非熒光淬滅基團(tuán)，從而大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度[61]。同時(shí)探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高5°C-10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan水解探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。③分子信標(biāo)分子信標(biāo)是一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針，和TaqMan探針一樣，其兩端也有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)修飾（圖1.3）[62]。體系中無(wú)模板時(shí)，探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定，釋放出的熒光信號(hào)非常微弱；體系中存在模板時(shí)，探針部分序列和模板特異結(jié)合，破壞發(fā)卡結(jié)構(gòu)使修飾的基團(tuán)分離，因而儀器可以接收到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)[63]。分子信標(biāo)廣泛運(yùn)用于病原體檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)[64,65]等方面。

上海大學(xué)碩士學(xué)位論文10圖1.3分子信標(biāo)原理Figure1.3PrinciplesofMolecularBeacons④其它熒光探針雙雜交探針（如圖1.4A）是兩個(gè)特異性探針，一個(gè)只5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一個(gè)只3’端標(biāo)記猝滅基團(tuán)。這兩個(gè)探針序列和模板特異性結(jié)合，結(jié)合的位置非常鄰近[66]。在qPCR反應(yīng)的退火階段，當(dāng)兩個(gè)探針與模板結(jié)合時(shí)，位于兩個(gè)探針頭尾的熒光基團(tuán)之間產(chǎn)生FRET現(xiàn)象，促進(jìn)受體的熒光基團(tuán)釋放一種波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，從而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程的目的。Amplifluor系統(tǒng)[67]（如圖1.4B）包括兩個(gè)特異性引物和一條通用引物（UniPrimer），其中一條引物的5’末端帶有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer兩端分別被熒光和淬滅基團(tuán)標(biāo)記且有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。反應(yīng)時(shí)，UniPrimer結(jié)合到特異性引物擴(kuò)增出的模板上作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在延伸的過(guò)程中UniPrimer發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光信號(hào)釋放。蝎形引物[68]（如圖1.4C）為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其5’端帶有一個(gè)熒光基團(tuán)FAM，3’端帶有一個(gè)淬滅基團(tuán)DABCYL，其環(huán)的部分序列和模板完全互補(bǔ)配對(duì)。體系有模板時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，熒光和淬滅基團(tuán)相距近，不能檢出熒光信號(hào)；體系無(wú)模板時(shí)，蝎形引物和模板特異性結(jié)合并起始PCR擴(kuò)增，蝎形引物的環(huán)結(jié)構(gòu)與擴(kuò)增出的模板互補(bǔ)雜交，導(dǎo)致莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出大量的熒光信號(hào)，熒光儀器可以實(shí)時(shí)收集這些熒光信號(hào)并生成相應(yīng)的熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌耐藥耐受性機(jī)制的最新研究進(jìn)展[J]. 李昕,曾潔,王岱,薛云新,趙西林.  中國(guó)抗生素雜志. 2020(02)
[2]實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)四種呼吸道病毒的研究[J]. 向蕾,陳仕菊,王昕,呂星,陸家海,房師松.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2014(04)
[3]抗生素的細(xì)菌耐藥性及應(yīng)對(duì)措施[J]. 任祥友,蔣瑞芹,崔玉芹.  中國(guó)民康醫(yī)學(xué). 2010(13)



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