生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展對光學(xué)顯微成像的性能,如空間分辨率、成像速度、多維度信息、成像質(zhì)量等提出了更高的要求。光片熒光顯微采用一個薄片光從側(cè)面激發(fā)樣品,在正交方向探測成像,具有快速三維層析成像和對樣品光漂白和光毒性小的優(yōu)點,是活體生物樣品長時間顯微觀測的理想工具。本文介紹了光片熒光顯微成像技術(shù)的基本原理及其主要特點;綜述了光片熒光顯微面臨的主要技術(shù)問題,以及為解決這些問題而發(fā)展出的新原理、新思路和新方法;例舉了光片熒光顯微成像技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用;討論了該技術(shù)的發(fā)展趨勢及前景。該研究旨在幫助研究者系統(tǒng)了解光片熒光顯微成像技術(shù)的基本知識、最新研究發(fā)展趨勢和潛在應(yīng)用,為該領(lǐng)域科學(xué)研究提供參考。 

【文章來源】：激光與光電子學(xué)進展. 2020,57(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：15 頁

【部分圖文】：

圖1 兩種顯微成像方式對比。（a）光片熒光顯微從側(cè)面用薄光片照明，只激發(fā)探測物鏡焦平面處的樣品發(fā)射熒光，在正交方向上收集熒光信號成像；（b）落射式熒光顯微用同一物鏡激發(fā)和收集熒光，光路經(jīng)過的在焦和離焦樣品都會被激發(fā)

圖1 兩種顯微成像方式對比。（a）光片熒光顯微從側(cè)面用薄光片照明，只激發(fā)探測物鏡焦平面處的樣品發(fā)射熒光，在正交方向上收集熒光信號成像；（b）落射式熒光顯微用同一物鏡激發(fā)和收集熒光，光路經(jīng)過的在焦和離焦樣品都會被激發(fā)3 光片熒光顯微的主要技術(shù)問題

研究人員通過掃描具有無衍射特性的貝塞爾光束、艾里光束等生成如圖3(b）和（c）所示的新型光片場，以解決光片熒光顯微系統(tǒng)觀測視場與軸向分辨率相互制約的問題。Planchon等[15]通過一維掃描傳播過程中能維持光束形貌不變的零階貝塞爾光束生成強度均勻的貝塞爾光片，然而貝塞爾光束的同心環(huán)狀旁瓣產(chǎn)生的離焦背景噪聲，既降低了成像對比度和系統(tǒng)軸向分辨率，又增大了光漂白和光毒性效應(yīng)。Fahrbach等[42]結(jié)合共聚焦技術(shù)解決了貝塞爾光片熒光顯微成像對比度和軸向分辨率低的問題，然而該方法合成一幅高對比度的二維圖像需要拍攝上百幅低對比度的圖像，系統(tǒng)的成像速度降低了兩個數(shù)量級。Olarte等[43]利用雙光子激發(fā)熒光有效抑制了貝塞爾光束旁瓣產(chǎn)生的離焦背景噪聲，并保證了系統(tǒng)的成像速度，但高強度超短飛秒光脈沖的光漂白性強且難以進行多色熒光成像。Vettenburg等[44]將艾里光片應(yīng)用到光片熒光顯微中，在保證軸向分辨率前提下將視場擴大了10倍（視場173μm×173μm，軸向分辨率0.86μm），但是艾里光片照明得到的熒光圖像必須進行去卷積處理才能真實還原出樣品信息。本課題組也開展了基于無衍射光束的光片熒光顯微研究，提出了互補光束相減光片熒光顯微成像技術(shù)（CBS-LSFM)[29]，它的原理如圖4所示。該方法的核心是設(shè)計并實驗生成貝塞爾光束的互補光束，該互補光束也具有無衍射特性，可滿足大視場成像需求；掃描該光束生成的互補光片中心光強為零，其他位置處強度分布和貝塞爾光片旁瓣強度分布一致[45]。分別用貝塞爾光片和互補光片照明樣品拍攝兩幅熒光圖像，然后將二者相減，可消除貝塞爾光束旁瓣對成像的影響，從而實現(xiàn)大視場高軸向分辨率成像（視場300μm×210μm，軸向分辨率1μm，橫向分辨率0.45μm）�；パa光片相減法用于光片熒光顯微同時引起其他科研人員的關(guān)注和研究[38,46]。為解決實驗系統(tǒng)噪聲影響成像質(zhì)量的問題，我們提出了一種基于壓縮感知盲解卷和去噪圖像處理方法[30]。該方法可同時對熒光圖像進行解卷和去噪處理，可有效抑制偽影，將信噪比提高2倍，顯著提高圖像對比度和質(zhì)量。互補光束相減法需要拍攝兩幅熒光圖像才能計算出一幅高分辨、高質(zhì)量的圖像，成像速度受到一定限制且會額外增加光劑量。為了解決該問題，利用深度學(xué)習(xí)進行圖像處理，可以直接從傳統(tǒng)的貝塞爾光片拍攝的圖像計算出與互補光片相減法一致的高質(zhì)量圖片，有效提高了成像速度并降低曝光劑量[31]。

【參考文獻】：
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