發(fā)布時間：2020-07-29 10:09

【摘要】：桿狀病毒是一類具有囊膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,在其生活史中,產(chǎn)生兩種不同類型的病毒粒子:出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV)。ODV負責(zé)病毒對中腸初始的口服感染,而BV則介導(dǎo)蟲體其他組織之間的系統(tǒng)感染。在ODV囊膜表面分布著至少10個與口服感染相關(guān)的蛋白,被稱為口服感染因子(per os infectivity factors,PIFs)。P74作為首個被報導(dǎo)的口服感染因子,也被稱為PIF0,它在ODV感染中腸的過程中經(jīng)歷兩次順序剪切:第一次剪切發(fā)生于ODV從多角體(occlusion body,OB)堿解釋放的過程中;第二次剪切發(fā)生于ODV感染中腸上皮細胞的過程中。目前,對于P74第一次剪切的具體位點及其對口服感染的影響尚不明確。本論文對ODV囊膜蛋白P74的剪切現(xiàn)象進行了深入分析研究,同時還探究了ODV囊膜表面口服感染因子間的相互作用,為深入揭示桿狀病毒口服感染的機制奠定了基礎(chǔ)。第一章介紹了研究背景,包括桿狀病毒的生活史及口服感染的詳細過程。同時對口服感染因子,特別是P74的研究現(xiàn)狀進行總結(jié)分析。第二章對苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)P74蛋白的剪切進行了研究。使用感染細胞樣品和蟲體來源的ODV樣品進行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)P74在細胞中不發(fā)生剪切,而在ODV樣品中發(fā)生剪切。隨后使用特異性抑制胰酶活性的大豆胰蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor,SBTI)進行OB堿解的時相實驗,發(fā)現(xiàn)SBTI加入時間越晚,P74剪切后的蛋白量越多,由此我們認為P74第一次剪切的可能是由胰蛋白酶或是類胰蛋白酶介導(dǎo)的。隨后,根據(jù)剪切條帶的大小及生物信息學(xué)分析,推測了四個保守的精氨酸位點可能為剪切位點,并通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了缺失p74,回復(fù)p74及七種預(yù)測剪切位點單、多點組合突變的重組病毒。我們對重組病毒進行掃描電鏡及透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)p74缺失及點突變不影響OB的外部形態(tài)及內(nèi)部ODV的包埋。我們將重組病毒的ODV純化后進行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)點突變R325Q/R334Q能夠部分抑制P74剪切,四點突變R319Q/R323Q/R325Q/R334Q能夠完全抑制P74的剪切,而其他的突變體不能,表明P74發(fā)生第一次剪切的位點是第319、323、325和334位的精氨酸。第三章對AcMNPV ODV囊膜表面10個口服感染因子之間的相互作用進行了探究。該實驗通過酵母雙雜交的方法雙向驗證各個PIF之間的相互作用,除去PIF5和VP91存在自激活現(xiàn)象無法研究外,共發(fā)現(xiàn)了8對雙向互作的蛋白,分別是:P74-PIF4、PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF2-PIF3、PIF2-PIF4、PIF3-PIF4、PIF4-Ac110。該實驗提示PIFs之間存在著廣泛的相互作用,支持了PIF以復(fù)合物形式發(fā)揮功能這一發(fā)現(xiàn),并為探究各個PIF蛋白在PIF復(fù)合物中可能的排布方式提供了重要數(shù)據(jù)。第四章為總結(jié)和展望,對本文的研究進行了總結(jié)歸納。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q939.4
【圖文】：

圖 1.1 桿狀病毒的生活史 (Rohrmann, 2013)e 1.1Baculovirus lifecycle.Baculovirus canbeabsorbed bylarvae taking virus moved to the midgut, ODVs were released from OBs to infect mido start oral infection (A). BVs were produced in infected cells and then rely cells, which was called systemic infection (B). Apart from BVs, oted cells nucleus can be wrapped into ODVs and then assembled with otheIn the end, host cells lysed and OBs were released to start next romann, 2013).病毒結(jié)構(gòu) ODV 在結(jié)構(gòu)上具有相似的核衣殼組分 (Slack andArif, 200囊膜上 (Hou et al., 2013)。首先在來源上，BV 的囊膜來源 ODV 的囊膜來源于感染細胞的核內(nèi)膜 (BraunagelandSum膜組分上二者也有很大差異，其中膜融合蛋白尤為明顯 (毒入侵和膜融合為單個蛋白——GP64 或 F 蛋白，GP64 屬于

圖 1.2 HearNPV BV 與 ODV 的蛋白組成和定位模式圖 (Hou et al., 2013)igure1.2ProteinscompositionsandlocalizationsofHearNPVBVandODV(Houetal.,20.1.3 桿狀病毒的應(yīng)用因為桿狀病毒ODV與BV的組織嗜性不同，因此在應(yīng)用上也有一定的差異DV 介導(dǎo)口服感染，因此可作為生物殺蟲劑，同時桿狀病毒特異性地感染節(jié)物 (Thiem,2009)，其安全性得到極大的保障，目前以 ODV 為基礎(chǔ)研發(fā)的生蟲劑得到國內(nèi)外的認可 (Yang et al., 2017 , Sun, 2015 , Inceoglu et al., 2001)。桿狀病毒的 BV 可作為基因表達載體，在感染的細胞內(nèi)大量表達外源蛋Keiletal.,2009,Miller,1989)。1993 年自“bacmid”系統(tǒng)開發(fā)以來 (Luckowet993)，BV 作為外源蛋白表達的系統(tǒng)一直在不斷的完善與發(fā)展，目前已被廣泛，同時像病毒樣顆粒 (virus-like particles, VLP) 及其他很多類疫苗也是由桿毒表達系統(tǒng)生產(chǎn) (Contreras-Gomez et al., 2014 , Lin et al., 2014)。此外，桿狀病毒可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法高效進入到包括人在內(nèi)多種動物細胞

圖 1.3 PIF 復(fù)合物模式圖 (Wang et al., 2019)re 1.3 Model of PIF complex formation (Wang et al.,主細胞可能是通過 ODV 囊膜和中腸細胞質(zhì)每個 PIF 在口服感染過程行使的功能尚不明05)，P74、PIF1、PIF2 在 ODV 吸附宿主細胞et al., 2014) 借用 EGFP 標記的 ODVs 發(fā)現(xiàn)缺。迄今為止，ODV 膜融合蛋白及受體結(jié)合蛋間相互作用白互作的手段通過形成復(fù)合物的形式來介導(dǎo)口服感染，因

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本文編號：2773815