發(fā)布時(shí)間：2020-07-29 07:26

【摘要】：磷脂雙分子層是自然界中最常見的自組裝結(jié)構(gòu)之一,它不僅為細(xì)胞和亞細(xì)胞區(qū)室提供保護(hù)性容器,還承載了許多用于細(xì)胞通訊和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白。人工制備的脂質(zhì)體和固體支持的磷脂雙分子層膜(SLB)作為最簡化的細(xì)胞和細(xì)胞膜模型,為研究細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng),跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),以及膜表面化學(xué)提供了極好的平臺(tái)。DNA分子是自然界中另一種具有卓越自組裝能力的材料。近年來,DNA納米結(jié)構(gòu)與功能化修飾技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展,被廣泛應(yīng)用于生物傳感,藥物遞送,邏輯計(jì)算等領(lǐng)域。將磷脂雙分子層與DNA納米技術(shù)進(jìn)行合理交叉結(jié)合,并借助當(dāng)前的單分子技術(shù),使得研究膜內(nèi)或膜表面酶促反應(yīng),藥物遞送等成為可能。本論文主要是以磷脂雙分子層為支撐平臺(tái),結(jié)合DNA納米技術(shù),研究細(xì)胞環(huán)境下單分子酶的動(dòng)力學(xué)機(jī)制以及細(xì)胞內(nèi)遞送。主要研究內(nèi)容如下:第一,針對(duì)在細(xì)胞環(huán)境中單分子酶動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究比較匱乏,本論文構(gòu)建了在模擬的細(xì)胞環(huán)境中對(duì)單分子酶可視化研究的平臺(tái)。通過將單個(gè)辣根過氧化物酶(HRP)包封在含有擁擠試劑的脂質(zhì)體中再連接到SLB界面,就可利用全內(nèi)反射顯微鏡實(shí)時(shí)監(jiān)測單分子酶促反應(yīng)過程中熒光強(qiáng)度的變化。分析結(jié)果表明在擁擠限域環(huán)境中酶分子活性狀態(tài)和抑制狀態(tài)的相關(guān)性減弱,產(chǎn)物對(duì)酶抑制程度降低。進(jìn)一步,利用小角X射線散射實(shí)驗(yàn)和模型重構(gòu),建立了擁擠環(huán)境中酶分子動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化與構(gòu)型變化的關(guān)系,對(duì)于理解生物學(xué)過程及研究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要指導(dǎo)意義。第二,目前,在溶液環(huán)境中對(duì)快速擴(kuò)散的蛋白動(dòng)態(tài)過程難以在單分子水平上進(jìn)行觀測,針對(duì)這一問題,本論文構(gòu)建了二維SLB膜上單分子酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)酶行為的可視化研究。將上游酶(過氧化氫酶)和下游酶(葡萄糖氧化酶)以不同方式錨定在SLB界面,就可以利用全內(nèi)反射顯微鏡實(shí)時(shí)追蹤二維界面上游酶和下游酶的運(yùn)動(dòng)行為。對(duì)單個(gè)酶運(yùn)動(dòng)軌跡的分析結(jié)果顯示,下游酶擴(kuò)散系數(shù)的增加呈現(xiàn)底物依賴性,但是運(yùn)動(dòng)方向隨機(jī)。實(shí)驗(yàn)和理論推導(dǎo)表明酶分子的‘趨向運(yùn)動(dòng)’是由平動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)競爭平衡的結(jié)果。本工作為研究蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)相互作用、抑制劑篩選等提供了新的思路。第三,將蛋白質(zhì)直接遞送到活細(xì)胞中在基礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用中仍然具有挑戰(zhàn)。本論文將膽固醇功能化的DNA分別修飾到脂質(zhì)體和細(xì)胞膜表面,實(shí)現(xiàn)了DNA反平行雜交介導(dǎo)的脂質(zhì)體與細(xì)胞的膜融合以及蛋白的胞內(nèi)遞送。其中,HRP被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)并遞送到細(xì)胞胞漿,利用HRP催化反應(yīng)產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物可視化驗(yàn)證了膜融合的發(fā)生,而且此過程不依賴于細(xì)胞內(nèi)吞。此外,利用鏈置換反應(yīng)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研究了膜融合的時(shí)空可控性,并在多元體系中實(shí)現(xiàn)了DNA介導(dǎo)脂質(zhì)體與細(xì)胞的特異性融合。最后將細(xì)胞色素C遞送到胞漿中引發(fā)細(xì)胞凋亡。此膜融合策略在蛋白藥物遞送,基因編輯方面都具有良好的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q73

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本文編號(hào)：2773627