發(fā)布時間：2020-06-14 12:05

【摘要】：氮作為大量元素,植物生長發(fā)育必不可少。硝酸鹽和銨鹽是土壤中氮的主要存在形式。最近研究表明土壤中少量氨基酸也可以被植物直接利用。從而支持植物生長、發(fā)育。在我國氮肥的大量使用增加了農(nóng)作物產(chǎn)量,但隨之生態(tài)環(huán)境也遭受到了嚴重破壞,為了更好的解決環(huán)境污染這一嚴峻問題,氮源轉(zhuǎn)運研究己經(jīng)成為了熱點,就目前而言氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究主要集中在擬南芥上,水稻氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究很少。酵母互補實驗首次報道OsLHT1為組氨酸轉(zhuǎn)運體,但基因功能尚不清楚。本研究的主要目的是分析OsLHT1的基因功能。主要結果包括:1.使用CRISPR/Cas9基因編輯技術,獲得了os1ht1-和os1ht1-2兩個突變體,表型分析發(fā)現(xiàn),OsLHT1基因功能喪失抑制了水稻根和莖的生長,葉片出現(xiàn)明顯褐色斑點表型,植物出現(xiàn)早衰跡象,種子千粒重,結實率等產(chǎn)量相關數(shù)據(jù)顯著降低從而間接說明了OsLHT1影響水稻發(fā)育。2.雙電極電壓鉗技術分析了 OsLHT1在爪蟾卵母細胞的底物選擇性。發(fā)現(xiàn)OsLHT1可以轉(zhuǎn)運堿性、中性和酸性等多種氨基酸。與它的擬南芥同源基因AtLHT1不同的是,OsLHT1對酸性和中性氨基酸具有更強的轉(zhuǎn)運活性。在檢測的11種氨基酸中,OsLHT1對Asn的轉(zhuǎn)運活性最強。3.QRT-PCR實驗數(shù)據(jù)分析表明,幼苗期根組織部位,分生區(qū)有最高表達量,莖和葉的表達量相比根較低,抽穗期OsLHT1基因在水稻根、莖、葉鞘、旗葉和穗等組織部位均有表達,其中旗葉中表達量高于其他組織。4.水稻原生質(zhì)體的瞬時表達系統(tǒng)表明OsLHT1于質(zhì)膜上表達。進一步說明了OsLHT1在膜上發(fā)揮重要的功能。5.為了驗證植物吸收氮與表型間的關系,進行了水培氨基酸,硝酸鹽吸收實驗,結果表明水稻根發(fā)育與硝酸鹽密切相關而確切轉(zhuǎn)運關系需要更多數(shù)據(jù)證明,而OsLHT1與氮源的關系復雜難以解釋清楚,植物總氮測表明OsLHT1可能參與了氮源吸收,以及氨基酸向上轉(zhuǎn)運過程。具體轉(zhuǎn)運,以及吸收需要后續(xù)更多實驗驗證。綜上所述,我們的研究結果表明,OsLHT1是一種氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白,具有廣泛的底物特異性,對中性氨基酸和酸性氨基酸有選擇性,OsLHT1功能的破壞明顯抑制了水稻的生長和繁殖。為了進一步探究OsLHT1功能以及推動氨基酸轉(zhuǎn)運體進展研究提供了一些可靠數(shù)據(jù)。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S511;Q943.2
【圖文】：

ＮＣＢＩ邋ＢＬＡＳＴ檢索得到擬南芥、玉米、短柄草、高粱和水稻的同源家族基因。１０個擬逡逑南芥、１６個玉米、１４個高梁、９個短柄草和６個水稻家族蛋白序列使用Ｍｅｇａ邋６．０的進逡逑化樹構建方法構建進化樹（圖３－１邋Ａ）。紅色的三角形標志著ＯｓＬＨＴｌ，結果顯示ＯｓＬＨＴｌ逡逑與邋ＺｍＮＰ＿００Ｉ１４Ｉ３６４、ＳｂＸＰ＿０２１３２０８６０、ＢｄＸＰ＿００３５７３３２６、ＡｔＬＨＴ２邋進化關系比較相逡逑近。為了更好地了解ＬＨＴ家族蛋白的保守結構特征，利用在線工具Ｍｅｍｅ來識別編碼逡逑的ＬＨＴ家族中的保守基序，并且每個基序?qū)挾缺幌拗圃冢常担皞�殘基之間。每個保守序逡逑列由不同的顏色框表示�；虻捻樞蚺c它們在單個蛋白質(zhì)序列中的位置相對應．結果顯示逡逑有十個保守結構被鑒定出，這對氨基酸轉(zhuǎn)運體研究提供了一些理論依據(jù)。逡逑２９逡逑

邐水稻l#基酸轉(zhuǎn)運體基因Ｃ＞ｓＺｊＶ７７的交杧與功期■研究逡逑名為１１３，邋Ｆ１代種子在０．５邋ｍＭＣａｄ２溶液中培養(yǎng)四天觀察表型，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生分離，分離逡逑比（長根：短根）約為３：１，說明該突變表型為隱性遺傳（如圖３－２）。逡逑灥逡逑圖３－２黃化粘突變體表型分析逡逑Ｆｉｇ．３－２邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｎｔ逡逑注：野生型和突變體水稻種子在含０．５邋ｍＭＣａＣｋ的溶液漂浮的網(wǎng)上培養(yǎng)５ｄ。比例尺為１厘米。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｅｅｄｓ邋ｏｆ邋ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔ邋ｐｌａｎｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｉｎ邋ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ邋ｗａｔｅｒ邋ｉｎ邋ｄａｒｋｎｅｓｓ邋ａｔ邋２８°Ｃ邋ｆｏｒ邋３邋ｄａｙｓ，逡逑ａｎｄ邋ｔｌｉｅｎ邋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋ａ邋ｎｅｔ邋ｆｌｏａｔｉｎｇ邋ｏｎ邋ａ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋０．５邋ｍＭ邋ＣａＣｈ邋ｆｏｒ邋５邋ｄ邋（１２－ｈ－ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ逡逑１２－ｈ－ｄａｒｋ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）．邋Ｂａｒ＝ｌｃｍ．逡逑３．２．２邋Ｍｕｔｍａｐ定位突變基因逡逑我們用無菌水將４００顆ＦＩ代種子在２８°Ｃ暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)３天，然后將發(fā)芽種子擺逡逑包含０．５ｍＭＣａｃｌ２溶液的網(wǎng)上２８°Ｃ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，五天后觀察表型，產(chǎn)生了根發(fā)育受抑逡逑制表型，長根：短根的分離比約為３：１，選取短根的種子，提�。模危�，送公司進行Ｍｕｔｍａｐ逡逑定位（重復三次）

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