【摘要】：β-葡萄糖苷酶(β-D-glucoβyranoside glucohydrolases,E.C.3.2.1.21)能夠特異性催化水解小分子寡糖、烴基以及芳香基團非還原性末端β-糖苷鍵生成葡萄糖,其作為纖維素酶的組分中主要的限速酶,對高效利用生物質(zhì)碳源有著重要意義。除此之外其在食品加工、養(yǎng)殖、生物醫(yī)學(xué)、種植等領(lǐng)域都有著重要使用價值,因此新型β-葡萄糖苷酶資源的開發(fā)具有深遠的生產(chǎn)意義。本試驗旨在通過從海南紅樹林環(huán)境中篩選出新型β-葡萄糖苷酶基因并通過研究其酶特性挖掘該酶資源的應(yīng)用潛力。主要研究結(jié)果如下:1.紅樹林土壤中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌的篩選、分離及鑒定試驗采用七葉素苷平板法從海南紅樹林土壤中成功篩選出9株具有明顯β-葡萄糖苷酶活性的真菌,并選取其中一株活性較高真菌H1進行后續(xù)實驗,該菌在微晶纖維素誘導(dǎo)下,發(fā)酵液上清中酶活達到了 19.1 U/ml;菌株H1經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列測序鑒定屬于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。2.哈茨木霉bgl基因的克隆及在其在畢赤酵母中的表達以NCBI數(shù)據(jù)庫中哈茨木霉IOC 3844的bgl基因(GenBank登錄號為:KU201604.1)為模板設(shè)計引物,利用反轉(zhuǎn)錄PCR從野生菌株H1中擴增得到完整的bgl基因,以pPICZαA為表達載體將H1 bgl基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33表達并測定最佳產(chǎn)酶周期,結(jié)果表明,H1 bgl片段全長1398 bp,經(jīng)比對與數(shù)據(jù)庫中哈茨木霉IOC 3844β-葡萄糖苷酶同源性最高,達到96.07%,沒有發(fā)現(xiàn)100%一致率的序列。產(chǎn)酶實驗測定最佳發(fā)酵周期為6d,最高活性為3.09 U/ml。3.哈茨木霉H1 bgl1蛋白的分離純化及其酶特性研究試驗通過陰離子交層析成功純化H1bgl蛋白,并用SDS-PAGE和BCA法分別檢測蛋白純度和濃度,最后以pNPG為底物分別測定不同溫度和pH下H1bglβ-葡萄糖苷酶活性及酶反應(yīng)動力參數(shù),結(jié)果表明,純化后酶液蛋白濃度為0.106 mg/ml,酶蛋白比活力為14 U/mg,SDS-PAGE檢測無明顯雜帶,分子量約80kD。最佳反應(yīng)pH為7.0,溫度為55℃,米氏常數(shù)Km=1.47 mM、專一性常數(shù)Kcat/Km=13.56(/s/mM)。綜上所述,試驗成功從紅樹林哈茨木霉中發(fā)現(xiàn)了一種新型β-葡萄苷酶資源,該酶具有優(yōu)秀的堿性環(huán)境適應(yīng)性,但其催化效率相對較弱,有待于進一步改造提升。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q55
【圖文】：

圖２菌株在七葉苷平板上產(chǎn)生的沉淀圈逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ邋ｐｒｏｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｅｓｃｕｌｉｎ邋ｐｌａｔｅ逡逑表６七葉素苷板沉淀圈測定結(jié)果逡逑Ｔａｂｌｅ邋６邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｅｓｃｉｎ邋ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ邋ｐｌａｔｅ邋ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｒｉｎｇ逡逑邐沉淀圈直徑（ｃｍ）邐顏色深淺逡逑１．７９土邋０．０６邐＊＊＊＊逡逑１．５７邋土邋０．０３邐＊＊＊＊逡逑１．７３邋土邋０．１２邐＊＊＊＊逡逑０．７４＋０．０４邐…逡逑２邐１．１７土邋０．０４邐＊＊＊逡逑０．９３＋０．０２邐…逡逑０．６１邋土邋０．０１邐＊＊逡逑１．３９邋土邋０．０６邐…逡逑邐１．４１邋土邋０．１３邐…逡逑注：表示顏色深淺，越多表示顏色越深。逡逑

圖３對硝基苯粉標準曲線逡逑Ｆｉｇ邋３邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ逡逑．２．２發(fā)酵液酶活測定逡逑將上述菌株以相同接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行同期發(fā)酵，每隔２４邋ｈ測定發(fā)酵逡逑上清中Ｐ－葡萄糖苷酶活性，共發(fā)酵７邋ｄ，選取各菌株發(fā)酵周期內(nèi)測定酶活最高值逡逑行對比，有３株菌株上清液中檢測到高活性，結(jié)果如表７所示。逡逑表７發(fā)酵液（６邋ｄ）上清中（５－葡萄糖昔酶活性逡逑Ｔａｂｌｅ邋５邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ邋ｉｎ邋ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ邋ｏｆ邋ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｂｒｏｔｈ邋（６邋ｄ）逡逑株編號邐最高酶活力（Ｕ／ｍｌ）逡逑－ｌ邐１２．８５邋土０．０４逡逑－ｌ邐１９．１０＋０．０６逡逑－２邐１０．７４邐土０．０３逡逑－ｌ邐—逡逑－２－２邐—逡逑－ｌ邐—逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2712596