【摘要】：尼古丁(Nicotine)具有高毒性,可透過(guò)生物膜,化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并且是致癌物質(zhì)煙草特有亞硝胺(TSNAs)的重要前體物,存在于環(huán)境中不易降解,嚴(yán)重污染環(huán)境。由于其特殊的水溶性,能夠與水以任意比例互溶,對(duì)人類生活及生態(tài)環(huán)境是一個(gè)極大的威脅。針對(duì)降解高毒、高危害的尼古丁微生物種類較少的實(shí)際情況,篩選出一株新的具有高尼古丁降解活性的菌株,探究其降解特性;研究了該菌的降解過(guò)程,對(duì)其降解條件進(jìn)行中心響應(yīng)面優(yōu)化;通過(guò)全基因組測(cè)序,分析并確定尼古丁相關(guān)基因簇,初步構(gòu)建ZUC-3尼古丁代謝途徑,并對(duì)降解關(guān)鍵基因進(jìn)行功能鑒定。旨在為尼古丁的生物降解相關(guān)領(lǐng)域及降解機(jī)制的研究提供新的微生物資源和理論依據(jù),研究結(jié)果表明:從煙草種植大田土壤分離純化得到一株具有高尼古丁降解能力的菌株,對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA基因序列同源性進(jìn)行了分析鑒定,探究了不同條件下尼古丁降解特性并對(duì)其動(dòng)態(tài)降解過(guò)程進(jìn)行了HPLC分析。經(jīng)鑒定命名為寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3,單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示其適宜的降解條件為:溫度30℃、起始pH 7.0、接種量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min,此條件下尼古丁降解率可達(dá)到91.53%,HPLC分析顯示ZUC-3降解尼古丁過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化及其高效性。在寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3降解尼古丁的Box-Behnken中心響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中,添加適量的蛋白胨和NH_4NO_3作為氮源,補(bǔ)充少量的葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽,通過(guò)PB(Plackett-Burman)試驗(yàn)篩選出對(duì)尼古丁降解率影響最顯著的三個(gè)因素是:溫度、時(shí)間和攪拌轉(zhuǎn)速。在PB試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,下一步進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì),由PB試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定爬坡方向與步長(zhǎng),逼近最優(yōu)區(qū)域,得到中心點(diǎn)為:溫度37℃,時(shí)間32 h,攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min,以此為中心點(diǎn)設(shè)計(jì)Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),構(gòu)建優(yōu)化模型得到最佳條件為:溫度30.13℃,時(shí)間35.41 h、攪拌轉(zhuǎn)速183.32 r/min,尼古丁降解率理論值為98.34%,并以此條件進(jìn)行實(shí)際降解試驗(yàn),得到實(shí)際尼古丁降解率為99.13%,擬合度達(dá)到99.20%,相比優(yōu)化前尼古丁降解率顯著提高。對(duì)高效尼古丁降解菌Stenotrophomonas sp.ZUC-3進(jìn)行全基因組測(cè)序及分析,基因組組裝共獲得90個(gè)Contigs,ZUC-3基因組大小為6.08 Mb,共得到5519條CDS序列,tRNA數(shù)量為74。通過(guò)與已知尼古丁降解相關(guān)基因的BLAST比對(duì),預(yù)測(cè)ZUC-3尼古丁降解相關(guān)基因的功能,ZUC-3尼古丁相關(guān)基因主要位于Contig3上,繪制出ZUC-3尼古丁降解基因簇,初步構(gòu)建ZUC-3菌株尼古丁代謝途徑。通過(guò)qRT-PCR測(cè)定ZUC-3降解途徑上9個(gè)降解基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明,當(dāng)尼古丁存在時(shí),9個(gè)降解基因的表達(dá)均顯著上調(diào)。對(duì)ZUC-3中降解關(guān)鍵基因hspB進(jìn)行分子克隆和功能驗(yàn)證,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得hspB基因,以pET 22b為載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET 22b-hspB,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá),采用SDS-PAGE進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證和檢測(cè),并對(duì)Hsp-B酶活進(jìn)行測(cè)定。構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET22b-hspB并成功表達(dá)HspB蛋白,其分子量為43.97 kDa,通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)其表達(dá)形式為包涵體,酶促反應(yīng)結(jié)果表明HspB蛋白具有較高的6-羥基-3-琥珀酰吡啶單加氧酶活性,明確了HspB的生物學(xué)功能和活性。
【圖文】：

圖 1.1 尼古丁 R/S 構(gòu)型化學(xué)結(jié)構(gòu)式的危害及毒性作為中樞神經(jīng)興奮劑的一種,吸食后可以使人產(chǎn)生心理和成癮性物質(zhì)。成年人一次吸入 50-60 mg 的尼古丁即可導(dǎo)尼古丁,可痹抑心臟[13]、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)。而且還會(huì)使稠度增加、心臟的供血量減緩、產(chǎn)生心絞痛,嚴(yán)重時(shí)能引

2 一株新的尼古丁降解菌的分離鑒定及降解特性與分析丁降解菌 ZUC-3 的分離及對(duì)尼古丁降解作用古丁為唯一碳氮源的尼古丁培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)初篩與復(fù)篩，從湖南省大田土壤樣品中分離得到 1 株具有高活性尼古丁降解能力將 ZUC-3 以 5 %的接種量接入尼古丁培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min 后，測(cè)定發(fā)酵液中尼古丁濃度及吸收光譜，結(jié)果如圖 2.1 所示： 259 nm 存在明顯的吸收峰，當(dāng)接入 ZUC-3 菌株發(fā)酵 48 h 后，明 ZUC-3 具有尼古丁降解能力。而且發(fā)酵液顏色在降解過(guò)程中：初期沒(méi)有發(fā)生顏色變化，當(dāng)培養(yǎng)至 12 h 左右發(fā)酵液顏色開始增加顏色逐漸變深呈墨綠色，24 h 左右墨綠色開始褪去，發(fā)酵液，這與目前已報(bào)道的微生物降解尼古丁過(guò)程中的發(fā)酵液顏色變化尼古丁降解過(guò)程中生成的中間產(chǎn)物可能不同。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：X592;X172

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本文編號(hào)：2704130