【摘要】：非冬眠動(dòng)物(大鼠、小鼠、人類等)在機(jī)械去負(fù)荷、禁食、缺血-再灌注等應(yīng)激狀態(tài)下,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,出現(xiàn)氧化應(yīng)激,長(zhǎng)時(shí)間的氧化應(yīng)激會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)氧化損傷。而冬眠動(dòng)物在“冬眠-陣間覺醒”循環(huán)中伴隨著“缺血-再灌注”、禁食和機(jī)械去負(fù)荷等多種應(yīng)激挑戰(zhàn),但是在其出眠后并未表現(xiàn)出明顯的氧化損傷跡象,對(duì)冬眠期多重應(yīng)激條件誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激表現(xiàn)出極強(qiáng)的防御能力。因此,探討冬眠動(dòng)物冬眠不同時(shí)期不同組織中氧化應(yīng)激水平變化及其調(diào)控機(jī)制是目前動(dòng)物生理學(xué)領(lǐng)域有關(guān)動(dòng)物對(duì)極端或特殊環(huán)境生理適應(yīng)機(jī)制研究的一大熱點(diǎn)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2[NF-E2]-related factor 2,Nrf2)/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)信號(hào)通路是公認(rèn)的抗氧化損傷的重要通路。當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)時(shí),Nrf2與Keap1解離而被激活,激活后的Nrf2易位至細(xì)胞核,與小Maf(small musculoaponeurotic fibrosarcoma)蛋白形成異二聚體并與抗氧化應(yīng)答元件(antioxident response element,ARE)結(jié)合,啟動(dòng)下游多種抗氧化酶表達(dá)上調(diào),從而清除過多的ROS,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。因此,本文將以冬眠哺乳動(dòng)物達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilus dauricus)為研究對(duì)象,檢測(cè)冬眠不同時(shí)期不同組織中氧化應(yīng)激水平(過氧化氫和丙二醛)的變化,以及主要的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的蛋白表達(dá)、酶活性及各組織的總抗氧化能力,就Nrf2/Keap1信號(hào)通路對(duì)冬眠動(dòng)物抗氧化防御的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究;另外,與廢用條件下大鼠骨骼肌萎縮程度、氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御能力進(jìn)行比較,探究冬眠動(dòng)物和非冬眠動(dòng)物骨骼肌在廢用條件下氧化應(yīng)激和肌萎縮的關(guān)系。本論文由三部分組成。第一部分:冬眠對(duì)達(dá)烏爾黃鼠不同組織中氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御能力的影響。過氧化氫(H_2O_2)是ROS的一種,能直接反映氧化應(yīng)激水平;丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物,可間接反映氧化應(yīng)激水平。本部分研究首先對(duì)心臟、肝臟、腦、腎臟和血漿的氧化應(yīng)激水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,與夏季活躍組相比,心臟和腦組織在冬眠陣晚期組中H_2O_2濃度顯著增加;MDA濃度在所有組織的陣間覺醒組和冬眠陣早期組均顯著降低,但是在腦組織的冬眠陣晚期組中顯著增加。出眠組所有組織中H_2O_2和MDA濃度均恢復(fù)至夏季組水平。這些結(jié)果表明,冬眠動(dòng)物各組織具有維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力。進(jìn)一步對(duì)抗氧化酶的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示,在冬眠-陣間覺醒周期中,心臟中超氧化物歧化酶2(SOD2)蛋白水平和肝臟中過氧化氫酶(CAT)蛋白水平一直維持高水平表達(dá);SOD1和谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)蛋白水平在所有組織的陣間覺醒和冬眠陣早期組均顯著升高;各種抗氧化酶的活性在所有組織的陣間覺醒和冬眠陣早期組中均高于冬眠陣晚期組;但是GPx活性在血漿的整個(gè)冬眠-陣間覺醒周期中都維持低活性。這些結(jié)果表明,在陣間覺醒期間,上調(diào)的抗氧化酶可能及時(shí)清除了各組織中由于缺血缺氧再灌注產(chǎn)生的過多的ROS。Nrf2/Keap1信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果顯示,p-Nrf2(磷酸化狀態(tài))的表達(dá)在所有組織的陣間覺醒組降低,但在冬眠陣晚期組顯著增加,尤其是在肝臟組織中。綜合上述結(jié)果,我們推測(cè),各組織中冬眠陣晚期組中增加的ROS可能通過激活Nrf2/Keap1抗氧化信號(hào)通路,上調(diào)下游多種抗氧化酶的表達(dá)及時(shí)清除過多的ROS,使其在陣間覺醒期維持較低的ROS水平,從而保護(hù)機(jī)體在冬眠-陣間覺醒周期中免受氧化損傷。第二部分:冬眠達(dá)烏爾黃鼠不同時(shí)期不同類型骨骼肌中氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御能力的研究。本部分研究選取不同類型的骨骼肌(慢縮肌:比目魚肌;快縮肌:趾長(zhǎng)伸肌;混合肌:腓腸肌),對(duì)其氧化-抗氧化水平及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,與夏季組相比,趾長(zhǎng)伸肌和腓腸肌中,H_2O_2含量在冬眠前和冬眠陣晚期組中顯著降低;MDA水平在趾長(zhǎng)伸肌和腓腸肌的整個(gè)冬眠-陣間覺醒周期中均顯著降低,在比目魚肌的陣間覺醒和冬眠陣早期組顯著下降,但是在其冬眠陣晚期組相比陣間覺醒和冬眠陣早期組顯著升高;出眠時(shí)H_2O_2和MDA濃度在三種肌肉中均恢復(fù)至夏季組水平�？寡趸傅慕Y(jié)果顯示,比目魚肌中CAT和GPx1以及腓腸肌中SOD2的蛋白表達(dá)在整個(gè)冬眠季均維持較高表達(dá)水平;趾長(zhǎng)伸肌中,SOD2蛋白表達(dá)在陣間覺醒和出眠組顯著升高,CAT和GPx1蛋白表達(dá)在冬眠中(包括冬眠陣早期組和冬眠陣晚期組)顯著升高。另外,三種肌肉組織中,多種抗氧化酶的活性在陣間覺醒組和冬眠陣早期組均不同程度的高于冬眠陣晚期組,CAT酶活性在三種肌肉的整個(gè)冬眠季均維持高活性。對(duì)Nrf2/Keap1信號(hào)通路的研究結(jié)果顯示,比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中Nrf2和p-Nrf2蛋白表達(dá)在整個(gè)冬眠季均顯著升高,在腓腸肌的冬眠前、陣間覺醒和冬眠陣早期組顯著升高。綜合上述結(jié)果,我們推測(cè),達(dá)烏爾黃鼠骨骼肌在冬眠期多重氧化應(yīng)激條件下,Nrf2/Keap1抗氧化信號(hào)通路的激活可能通過上調(diào)多種抗氧化酶的表達(dá)及時(shí)清除了冬眠陣循環(huán)中骨骼肌中產(chǎn)生的過多的ROS,使其在整個(gè)冬眠期都能維持較低的ROS水平,保護(hù)骨骼肌免受氧化損傷。第三部分:對(duì)后肢去負(fù)荷大鼠和冬眠不活動(dòng)達(dá)烏爾黃鼠不同類型骨骼肌氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御能力以及肌萎縮程度的比較研究。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,后肢去負(fù)荷14天后,大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌肌重、肌重-體重比和肌纖維橫截面積均顯著下降。但是,冬眠組黃鼠(不活動(dòng)兩個(gè)月)的這幾項(xiàng)指標(biāo)與夏季組相比均沒有出現(xiàn)顯著變化。對(duì)氧化應(yīng)激水平的檢測(cè)結(jié)果顯示,后肢去負(fù)荷組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌中H_2O_2水平與對(duì)照組相比均顯著增加,比目魚肌中MDA水平也顯著增加;但是冬眠不活動(dòng)組黃鼠與夏季組相比,骨骼肌中氧化應(yīng)激水平在比目魚肌中沒有顯著升高,在趾長(zhǎng)伸肌中顯著下降。后肢去負(fù)荷組大鼠比目魚肌中SOD2、CAT和GPx1蛋白表達(dá)均顯著下降,但是SOD1蛋白表達(dá)顯著升高;趾長(zhǎng)伸肌中GPx1蛋白表達(dá)也顯著下降。但是冬眠不活動(dòng)組黃鼠骨骼肌中SODs蛋白表達(dá)維持正常水平,CAT和GPx1蛋白水平顯著增加。Nrf2和p-Nrf2蛋白水平在后肢去負(fù)荷大鼠比目魚肌中沒有出現(xiàn)顯著變化,但在趾長(zhǎng)伸肌中顯著降低;冬眠不活動(dòng)黃鼠骨骼肌中Nrf2和p-Nrf2蛋白水平均顯著升高。綜合上述結(jié)果,大鼠在廢用條件下,骨骼肌中Nrf2/Keap1抗氧化信號(hào)通路被抑制,下游抗氧化酶表達(dá)下調(diào),骨骼肌中氧化應(yīng)激水平升高,因此,我們推測(cè)后肢去負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌氧化應(yīng)激水平升高,抗氧化防御能力減弱,可能是導(dǎo)致廢用性肌萎縮的重要機(jī)制之一。黃鼠在冬眠不活動(dòng)期間,骨骼肌中Nrf2/Keap1抗氧化信號(hào)通路被激活,抗氧化酶表達(dá)上調(diào),骨骼肌中ROS維持生理水平,因此,我們推測(cè),冬眠動(dòng)物在低代謝狀態(tài)和骨骼肌廢用狀態(tài)下,抗氧化防御能力增強(qiáng)可能是防止冬眠不活動(dòng)引起的廢用性肌萎縮的重要機(jī)制。總之,在廢用條件下,非冬眠動(dòng)物和冬眠動(dòng)物骨骼肌中氧化應(yīng)激水平和Nrf2介導(dǎo)的抗氧化信號(hào)通路的表現(xiàn)明顯不同,可能是其肌萎縮程度不同的一個(gè)重要原因。綜上所述,本研究對(duì)達(dá)烏爾黃鼠冬眠不同時(shí)期不同組織中氧化應(yīng)激水平、抗氧化防御能力及其調(diào)控機(jī)制等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究,結(jié)果顯示,冬眠黃鼠不同組織在冬眠陣晚期組中ROS水平有不同程度上升,但是出眠時(shí)均恢復(fù)至夏季組水平,表明冬眠達(dá)烏爾黃鼠在多重應(yīng)激條件下,具有維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的能力。其次,心臟和腦組織在冬眠陣晚期組中ROS水平顯著高于夏季活躍組,表明不同組織對(duì)氧化應(yīng)激具有不同的敏感性。第三,多種抗氧化酶的變化模式具有組織特異性。比如CAT蛋白在肝臟組織的整個(gè)冬眠季維持較高水平表達(dá),但是在腦組織中并沒有顯著變化;GPx1和CAT蛋白表達(dá)在比目魚肌整個(gè)冬眠季均顯著升高,但是在腓腸肌中沒有顯著變化。第四,對(duì)廢用條件下的冬眠黃鼠和后肢去負(fù)荷大鼠骨骼肌萎縮程度和氧化應(yīng)激水平及抗氧化調(diào)控的比較研究顯示,后肢去負(fù)荷組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌肌肉萎縮明顯,ROS水平顯著升高,多種抗氧化酶的表達(dá)顯著下降,從而表明,后肢去負(fù)荷導(dǎo)致骨骼肌氧化應(yīng)激水平升高,抗氧化防御能力減弱,可能是誘導(dǎo)廢用性肌萎縮的重要機(jī)制之一;但是冬眠不活動(dòng)組黃鼠骨骼肌并未出現(xiàn)明顯萎縮,且氧化應(yīng)激水平維持穩(wěn)定狀態(tài),多種抗氧化酶出現(xiàn)高表達(dá),從而表明,冬眠動(dòng)物在低代謝和廢用狀態(tài)下抗氧化防御能力的增強(qiáng)可能是防止冬眠不活動(dòng)引起的廢用性肌肉萎縮的重要機(jī)制。以上研究不僅為我們了解冬眠黃鼠對(duì)特殊生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供了新視角,也將為與自由基相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)和新的思路。
【圖文】：

3圖 1.1 哺乳動(dòng)物冬眠陣示意圖。A：冬眠期間體溫的波動(dòng)變化(Carey et al., 2003; 尹秋媛, 2016)。橫坐標(biāo)代表時(shí)間（月份），冬眠時(shí)期是從 9 月中旬至次年 4 月；縱坐標(biāo)代表體溫變化。summer active：夏季活躍；hibernation season：冬眠季；IBA：interbout arousal，陣間覺醒。下圖為冬眠-陣間覺醒循環(huán)（torpor-interbout arousal）的放大圖。EN：entrance，進(jìn)入冬眠；ET：early torpor，冬眠早期；LT：late torpor，，冬眠晚期；AR：arousing，正在覺醒；IBA：interbout arousal，陣間覺醒。B：冬眠哺乳動(dòng)物的生活史示意圖

其氧化程度超出氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起的應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞中 ROS 主要包括超氧陰離子（O2-·）、羥基自由基（OH·）、過氧化氫（H2O2）和脂質(zhì)過氧化物（LOOH）等。細(xì)胞中很多生理生化過程都會(huì)產(chǎn)生 ROS，根據(jù)其產(chǎn)生的途徑主要分為以下三類(尹秋媛, 2016; 魏艷紅等, 2018)：線粒體電子傳遞是 ROS 產(chǎn)生的最主要途徑。人和動(dòng)物體內(nèi)在細(xì)胞呼吸和能量代謝過程中時(shí)刻發(fā)生著有氧氧化，分子氧經(jīng)線粒體電子傳遞鏈傳遞被還原成水，產(chǎn)生ATP。然而電子在經(jīng)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ（complex Ⅰ；NADH 脫氫酶復(fù)合體，NADH ubiquinone oxidoreductase）和復(fù)合體Ⅲ（complexⅢ；細(xì)胞色素 c 還原酶復(fù)合體，ubiquinone-cytochrome c oxidase）傳遞過程中極易發(fā)生逃逸，與分子氧作用生成諸如 O2-·，OH·和 H2O2等形式的 ROS(Halliwell et al., 1994; Raha et al., 2000; Turrens2003; Murphy 2009)（圖 1.2）。在生物體所消耗的氧氣中，大約有 1-2%的氧氣產(chǎn)生O2-·和 H2O2。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q418

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2704246