【摘要】：蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾,糖鏈與蛋白質(zhì)氨基酸連接的位點(diǎn)稱為糖基化位點(diǎn)。糖蛋白質(zhì)組學(xué)的分析一般包括糖基化位點(diǎn)的檢測,糖鏈結(jié)構(gòu)的解析和完整糖肽鑒定。糖蛋白組學(xué)分析的樣品處理步驟一般包括蛋白質(zhì)的酶解、糖蛋白或糖肽的富集、去糖基化和脫鹽等。然而目前的大多數(shù)方法只能單一地分析糖基化位點(diǎn)和糖鏈,不僅操作耗時(shí)并受到毫克級蛋白質(zhì)起始量的限制。本論文基于槍頭設(shè)計(jì)了一種簡單、集成化的糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(simple and integrated spintip-based glycoproteomics technology,Glyco-SISPROT)。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對毫克級別微量蛋白質(zhì)樣品的處理,并在較短的處理時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)糖蛋白質(zhì)組的全面分析。通過將強(qiáng)陽離子交換填料SCX,C_(18)填料和伴刀豆球蛋白凝集素填料ConA整合到槍頭內(nèi),并優(yōu)化用量和填充方式形成了Glyco-SISPROT技術(shù)。該技術(shù)能高效地處理組織樣品來源的蛋白質(zhì)和多肽樣品,并實(shí)現(xiàn)完整糖肽、糖鏈和去糖肽的同時(shí)大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析。通過使用多種糖苷酶組合,約1770個(gè)去糖肽和1850個(gè)糖基化位點(diǎn)可以被成功地從100微克的小鼠肝臟蛋白質(zhì)或100微克的小鼠肝臟多肽中檢測到。其中,PNGase F糖苷酶和Endos糖苷酶都能檢測到的糖基化位點(diǎn)約占30%。此外,以蛋白質(zhì)為起始原料,Glyco-SISPROT技術(shù)能將幾天的處理時(shí)間縮短到6個(gè)小時(shí)左右,并具有良好的操作重現(xiàn)性(單針小鼠肝樣品Pearson相關(guān)系數(shù)0.92)�？傊�,Glyco-SISPROT技術(shù)是使用有限的蛋白質(zhì)作為起始原料得到最全面的糖蛋白質(zhì)組信息的方法之一。該技術(shù)適用于稀有生物樣品的高靈敏度,全方面的糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
【圖文】：

圖 1-1 不同糖苷酶的特異性a) PNGase F 糖苷酶的特異性 b) Endo 糖苷酶的特異性2.2 集成化糖蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展傳統(tǒng)的糖蛋白質(zhì)分析策略的分析，包括蛋白質(zhì)的提取，蛋白質(zhì)的酶解，的富集，去糖肽和脫鹽等步驟都是在溶液內(nèi)進(jìn)行。為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的糖基點(diǎn)鑒定，蛋白質(zhì)的肽鍵和糖苷鍵的酶解都需要較長的反應(yīng)時(shí)間。2009 年，Zhou H 等人發(fā)展了一種以 ConA 樹脂為富集材料的糖蛋白質(zhì)組應(yīng)器[38]。糖蛋白質(zhì)在富集后轉(zhuǎn)移到糖蛋白質(zhì)組反應(yīng)器中，該反應(yīng)器結(jié)合了質(zhì)的純化、二硫鍵還原、去糖基化、胰蛋白酶酶解和分餾操作。在 5 μL 的血漿中鑒定到 41 種糖蛋白和 82 種糖肽，并將樣品處理時(shí)間縮短至 2 小時(shí)著減少了試劑的消耗。該糖蛋白反應(yīng)器提供了更大的蛋白質(zhì)覆蓋度和更高定準(zhǔn)確性。但是這里的起始蛋白是已經(jīng)富集分離過的糖蛋白，并沒有實(shí)現(xiàn)步驟在內(nèi)的集成化，反應(yīng)器外的富集過程中會造成部分的樣品損失。2011 年angY 等人發(fā)展了一種集成化的樣品前處理系統(tǒng)，由親水色譜柱(Hydroph

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文的合成速率比降解速率高，，這與細(xì)胞生長的事實(shí)一致。.2 糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的富集和酶解在生物樣品中，具有診斷和治療意義的蛋白質(zhì)比其他蛋白質(zhì)的含量低。由一種蛋白質(zhì)的糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基化是不確定的，糖基化位點(diǎn)連接的糖鏈?zhǔn)且彩遣淮_定的，形成的糖蛋白具有不均一性和多樣性等特點(diǎn)。選擇有效的富集方法來降低樣品的復(fù)雜度是基于質(zhì)譜技術(shù)糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析的第一富集方法的選擇對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究起關(guān)鍵作用。如圖 1-2 所示，常見的糖富集方法主要有凝集素富集法，酰肼化學(xué)法，親水作用色譜法和硼酸親和法。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q51

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本文編號：2703055