糙皮側(cè)耳作為一種大型木腐真菌,通過分泌漆酶來降解培養(yǎng)料中的木質(zhì)素。在糙皮側(cè)耳基因組中共有12條假定的漆酶編碼基因,其中,poxc(lacc10)基因的編碼產(chǎn)物是一種典型的糙皮側(cè)耳漆酶,并且其表達(dá)量在糙皮側(cè)耳整個生長發(fā)育過程中均很高。ltf4是通過應(yīng)用酵母單雜交技術(shù),利用糙皮側(cè)耳poxc核心啟動子序列構(gòu)建誘餌菌株,從子實(shí)體cDNA文庫中得到的基因。本文以糙皮側(cè)耳新831菌株作為研究對象,對ltf4基因進(jìn)行了如下研究:擴(kuò)增ltf4基因的CDS區(qū)并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)對ltf4和poxc基因進(jìn)行表達(dá)模式分析;對ltf4基因進(jìn)行原核異源表達(dá)及蛋白純化;利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測LTF4與poxc核心啟動子序列的互作情況;構(gòu)建ltf4基因的過表達(dá)和反義沉默載體,為ltf4基因功能的體內(nèi)分析做準(zhǔn)備。本文主要結(jié)論如下:1、以糙皮側(cè)耳子實(shí)體期cDNA為模板進(jìn)行PCR,成功克隆得到了糙皮側(cè)耳ltf4基因的CDS區(qū),ltf4基因CDS區(qū)長1,608 bp,編碼產(chǎn)物長535 aa。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示:LTF4與糙皮側(cè)耳PC15中某假定蛋白(KDQ29010.1)...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 糙皮側(cè)耳漆酶
        1.1.1 糙皮側(cè)耳漆酶的酶學(xué)性質(zhì)
        1.1.2 糙皮側(cè)耳漆酶的基因表達(dá)
    1.2 真菌轉(zhuǎn)錄因子研究
        1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)
        1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子的研究方法
            1.2.2.1 凝膠阻滯
            1.2.2.2 DNase I足跡法
            1.2.2.3 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)
    1.3 基因功能的研究方法
        1.3.1 基因敲除
        1.3.2 RNA干擾
        1.3.3 反義RNA技術(shù)
        1.3.4 超表達(dá)
第二章 引言
    2.1 研究依據(jù)及意義
    2.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
第三章 糙皮側(cè)耳ltf4 基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和載體
        3.1.2 培養(yǎng)基
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 糙皮側(cè)耳子實(shí)體期總RNA提取
            3.2.1.1 利用Trizol試劑提取糙皮側(cè)耳總RNA
            3.2.1.2 總RNA質(zhì)量檢測方法
        3.2.2 cDNA第一條鏈的合成
        3.2.3 糙皮側(cè)耳ltf4基因全長CDS區(qū)的擴(kuò)增
        3.2.4 目的產(chǎn)物的回收純化
        3.2.5 目的基因連接T載體
            3.2.5.1 目的基因3’端加“A”
            3.2.5.2 目的基因與T載體連接
        3.2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            3.2.6.1 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.2.6.2 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
        3.2.7 篩選陽性轉(zhuǎn)化子
        3.2.8 糙皮側(cè)耳ltf4 基因生物信息學(xué)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 糙皮側(cè)耳ltf4 基因全長CDS區(qū)的擴(kuò)增
            3.3.1.1 ltf4 基因比對結(jié)果
            3.3.1.2 糙皮側(cè)耳子實(shí)體期總RNA提取及c DNA合成
            3.3.1.3 擴(kuò)增糙皮側(cè)耳ltf4基因的全長CDS區(qū)
            3.3.1.4 ltf4 基因CDS區(qū)測序及分析
        3.3.2 糙皮側(cè)耳LTF4 功能預(yù)測及結(jié)構(gòu)分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 ltf4 基因的原核表達(dá)及蛋白純化
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 儀器
        4.1.5 溶液配制
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 原核表達(dá)載體pEASY-E2-ltf4 的構(gòu)建
            4.2.1.1 PCR產(chǎn)物與pEASY-E2 表達(dá)載體連接
            4.2.1.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            4.2.1.3 陽性克隆的檢測
        4.2.2 原核表達(dá)載體pEASY-E2-ltf4 轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞
        4.2.3 ltf4 基因的誘導(dǎo)表達(dá)
            4.2.3.1 菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子
            4.2.3.2 誘導(dǎo)表達(dá)
            4.2.3.3 SDS-PAGE檢測
        4.2.4 蛋白純化
        4.2.5 目的蛋白的濃縮
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 原核表達(dá)載體pEASY-E2-ltf4 的構(gòu)建
        4.3.2 原核表達(dá)及SDS-PAGE分析
        4.3.3 蛋白純化及濃縮
    4.4 本章小結(jié)
第五章 糙皮側(cè)耳漆酶基因poxc及其轉(zhuǎn)錄因子基因ltf4 的表達(dá)模式分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 培養(yǎng)基
        5.1.3 主要試劑
        5.1.4 主要儀器
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 糙皮側(cè)耳的栽培
        5.2.2 提取糙皮側(cè)耳不同生長時期的總RNA
        5.2.3 cDNA第一條鏈的合成
        5.2.4 半定量RT-PCR
            5.2.4.1 設(shè)計(jì)引物
            5.2.4.2 PCR擴(kuò)增
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 糙皮側(cè)耳漆酶基因poxc表達(dá)模式分析
        5.3.2 糙皮側(cè)耳ltf4 基因表達(dá)模式分析
    5.4 本章小結(jié)
第六章 LTF4 與漆酶基因poxc核心啟動子區(qū)的體外互作研究
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 菌株與質(zhì)粒
        6.1.2 培養(yǎng)基
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 儀器
        6.1.5 溶液配制
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 探針的擴(kuò)增
            6.2.1.1 提取糙皮側(cè)耳新831 基因組DNA
            6.2.1.2 PCR擴(kuò)增糙皮側(cè)耳漆酶poxc核心啟動子區(qū)域
            6.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化p MD19-T simple載體連接
            6.2.1.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞
            6.2.1.5 陽性克隆的篩選與鑒定
            6.2.1.6 測序結(jié)果分析
        6.2.2 雙鏈探針的標(biāo)記
            6.2.2.1 陽性質(zhì)粒的酶切
            6.2.2.2 待標(biāo)記探針的純化
            6.2.2.3 DIG標(biāo)記雙鏈探針
            6.2.2.4 已標(biāo)探針的純化
            6.2.2.5 已標(biāo)探針的效率檢測
        6.2.3 結(jié)合反應(yīng)
        6.2.4 電泳
        6.2.5 轉(zhuǎn)膜
        6.2.6 免疫檢測
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3.1 糙皮側(cè)耳漆酶基因poxc核心啟動子區(qū)域的擴(kuò)增
        6.3.2 陽性克隆的篩選
        6.3.3 pMD19-T Simple-poxc407 質(zhì)粒的酶切及poxc407 片段的回收
        6.3.4 DIG標(biāo)記雙鏈探針的純化
        6.3.5 已標(biāo)探針的效率檢測
        6.3.6 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)
    6.4 本章小結(jié)
第七章 糙皮側(cè)耳ltf4 基因過表達(dá)載體和反義沉默載體的構(gòu)建
    7.1 實(shí)驗(yàn)材料
        7.1.1 菌株和質(zhì)粒
        7.1.2 培養(yǎng)基
        7.1.3 主要試劑
        7.1.4 儀器
    7.2 實(shí)驗(yàn)方法
        7.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建方法與策略
        7.2.2 糙皮側(cè)耳基因ltf4 過表達(dá)與反義沉默片段的克隆
            7.2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            7.2.2.2 ltf4-XbaI片段的PCR擴(kuò)增
        7.2.3 ltf4-Xba I片段TA克隆
            7.2.3.1 ltf4-XbaI片段3’端加“A”
            7.2.3.2 ltf4-XbaI片段與p MD19-Tsimple載體連接
        7.2.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
        7.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選
        7.2.6 糙皮側(cè)耳過表達(dá)與反義沉默表達(dá)載體的構(gòu)建
            7.2.6.1 pMD19-T-ltf4-XbaI重組質(zhì)粒與p Po-GPD表達(dá)載體的酶切、酶連
            7.2.6.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
            7.2.6.3 陽性克隆的篩選與鑒定
            7.2.6.4 測序結(jié)果分析
    7.3 結(jié)果與分析
        7.3.1 糙皮側(cè)耳ltf4-XbaI片段的克隆
        7.3.2 糙皮側(cè)耳ltf4 過表達(dá)與反義沉默載體的構(gòu)建
    7.4 本章小結(jié)
第八章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化糙皮側(cè)耳
    8.1 實(shí)驗(yàn)材料
        8.1.1 菌種和質(zhì)粒
        8.1.2 培養(yǎng)基
        8.1.3 主要試劑
        8.1.4 儀器
        8.1.5 溶液配制
    8.2 實(shí)驗(yàn)方法
        8.2.1 過表達(dá)及反義沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
        8.2.2 篩選陽性轉(zhuǎn)化子
        8.2.3 過表達(dá)及反義沉默載體轉(zhuǎn)化糙皮側(cè)耳
            8.2.3.1 糙皮側(cè)耳潮霉素致死濃度的探究
            8.2.3.2 糙皮側(cè)耳菌絲塊的培養(yǎng)
            8.2.3.3 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)
            8.2.3.4 農(nóng)桿菌與糙皮側(cè)耳共培養(yǎng)
            8.2.3.5 糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)化子的初篩與復(fù)篩
    8.3 結(jié)果與分析
        8.3.1 過表達(dá)及反義沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
        8.3.2 糙皮側(cè)耳潮霉素致死濃度的探究
        8.3.3 糙皮側(cè)耳轉(zhuǎn)化子的初篩與復(fù)篩
    8.4 本章小結(jié)
第九章 結(jié)論與討論
    9.1 主要結(jié)論
    9.2 討論
    9.3 后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)想
參考文獻(xiàn)
英文摘要



本文編號：3756140