【摘要】：雙色百合花具有奇特的花被片,具有極高的觀賞價值。在百合‘Tiny Padhye’雙色花被片發(fā)育的過程中,花被片下部逐漸由綠色變?yōu)樽仙?而上部由綠色變?yōu)榘咨�。然�?百合雙色花形成的分子機理尚未揭示。百合雙色花形成的分子機理的揭示可以為百合花色的人工調控及百合花色分子改良提供理論依據(jù)。本研究在測定雙色百合花被片發(fā)育過程中葉綠素、花青素苷含量變化的基礎上,通過RNA-seq技術測定雙色花百合‘Tiny Padhye’上下部不同發(fā)育時期的花被片的轉錄組,通過生物信息學手段鑒定與葉綠素代謝以及花青素苷合成通路相關的結構基因和轉錄因子,并對參與百合雙色花形成的關鍵基因LhUFGT和Lh SGR進行了鑒定和功能研究,從而揭示百合雙色花形成的分子機制。主要研究結果如下:1.雙色花百合‘Tiny Padhye’花被片發(fā)育過程中花青素苷和葉綠素含量變化HPLC結果表明,在百合紫色花被片下部,僅有矢車菊素3-O-β-蕓香糖苷這一種花青素苷成分。在花被片上部未檢測到花青素苷的存在。在花被片下部,花青素苷從花被片發(fā)育第一時期(S1)到第三時期(S3)逐漸升高,在第四時期(S4)則開始下降。葉綠素主要積累在花被片早期(S1和S2時期)的上下部,而在發(fā)育后期(S3和S4時期)的花被片中含量逐漸降低。2.百合雙色花發(fā)育形成過程的轉錄組分析為了系統(tǒng)地研究不同發(fā)育時期百合雙色花花被片的時空轉錄組變化情況,我們對雙色花百合‘Tiny Padhye’的S2時期花被片的上下部以及對S1、S3和S4三個時期下部分別進行了轉錄組測序。共獲得713,120,548條高質量序列,從頭組裝共獲得295,787條unigenes。KEGG分析表明,61個unigenes屬于了花青素苷合成基因;106個unigenes屬于葉綠素代謝通路結構基因。進一步的差異基因表達分析表明,花青素苷合成基因在花被片下部特異協(xié)同表達導致花青素苷特異地積累于花被片下部,而在花被片上部不表達。百合花被片中葉綠素含量逐漸下降的原因為隨著花被片的發(fā)育,葉綠素合成相關結構基因在花被片上下部的表達量逐漸下降,而葉綠素降解相關結構基因的表達量迅速上升。此外,通過WGCNA分析,參與調控百合花被片中花青素苷合成通路以及葉綠素代謝通路的候選轉錄因子也得以鑒定。3.百合雙色花花被片發(fā)育過程中qRT-PCR內參基因的篩選qRT-PCR是一項廣泛應用于基因表達水平研究的技術,該技術的準確性依賴于穩(wěn)定表達的內參基因。本研究中,10個植物中常用作內參基因的持家基因被選為候選內參基因。分別使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder和比較ΔCt法評價了這些候選內參基因在百合‘Tiny Padhye’不同發(fā)育時期花被片中以及不同試驗條件下的穩(wěn)定性。最終結果表明:在花被片不同發(fā)育時期中,TIP41和ACT為最適內參組合;在花被片遮光處理中,TIP41和F-box為最佳內參組合;在不同組織中,ACT、ACT11和EF1-α為最佳內參組合;在所有樣品中,ACT、TIP41、ACT11為最佳內參組合。使用穩(wěn)定性不同的內參分別計算了兩個花青素苷合成相關基因LhF3′H和LhUFGT的表達水平,該結果進一步驗證了篩選到的最適內參基因的可靠性。4.花青素糖基化基因Lh UFGT的克隆及功能研究克隆得到花青素糖基化關鍵基因LhUFGT基因,其開放閱讀框(ORF)為1371 bp,編碼456個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明,該基因編碼的氨基酸序列與已報道的3GTs蛋白聚在一起�；驎r空表達分析表明,該基因在S1時期花被片下部不表達,而在S2和S3下部表達量最高,之后隨著花被片的發(fā)育表達量逐漸下降;該基因在各個發(fā)育時期的花被片上部表達量均很低。該基因的表達趨勢和花被片中花青素苷含量的變化趨勢較相似。通過同源重組的方法成功構建含該基因ORF區(qū)的過表達載體pCAMBIA3301-Lh UFGT。該基因可以恢復3GT基因功能缺失的擬南芥突變體(ugt78d2)的表型。以上結果均表明LhUFGT蛋白具有3GTs家族成員的酶催功能。5.葉綠素降解基因Lh SGR的克隆及功能研究克隆得到葉綠素降解關鍵基因LhSGR基因,其開放閱讀框(ORF)為753 bp,編碼250個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明,該基因編碼的蛋白與已報道的單子葉植物SGRs蛋白聚在一起�；驎r空表達分析表明,該基因的表達趨勢和花被片中葉綠素含量的變化成負相關,在花被片早期(S1和S2)表達量較低而在發(fā)育后期(S3和S4)含量較高。在煙草葉片中瞬時過表達該基因可以導致煙草葉片黃化。證明該基因參與百合花被片中葉綠素降解過程。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S682.29
【圖文】：

花青素的基本化學結構

2圖 1.2 花青素苷的生物合成途徑（Albert et al.，2011）Fig.1.2 Pathway of anthocyanin biosynthesis（Albert et al.，

圖 1.3 花青素苷合成的調控網絡（Albert et al.，2014）Fig.1.3 Anthocyanin gene regulation network（Albert et al.，2014）研究發(fā)現(xiàn)，花青素苷激活因子 R2R3-MYBs 的時空表達受 HY5、NAC、SPL 和 LBD 等轉因子的調控。在強光條件下，擬南芥 NAC 轉錄因子 ANAC078 通過活化花青素苷生物合成相基因來誘導花青素苷的積累（Morishita et al.，2009）。擬南芥 HY5 可以直接結合到基因 PA

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本文編號：2792801