弧菌廣泛分布于海水養(yǎng)殖環(huán)境內,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,弧菌一直被認為是很多海洋魚類或無脊椎動物特別是蝦的主要致病菌。凡納濱對蝦是世界對蝦養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟品種,隨著對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展,養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化,由弧菌引發(fā)的對蝦疾病,影響對蝦的生長繁殖,引起對蝦的大量死亡,已經(jīng)在全球范圍內造成了重大經(jīng)濟損失,成為對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要制約因素。解決病害問題需要從病原感染機理等研究入手。本研究共分為兩個部分：第一部分基于Cox比例風險模型,探究哈氏弧菌不同菌株、劑量及感染方式對凡納濱對蝦的攻毒效果的影響。目前相當多的研究揭示了許多因素影響弧菌病的爆發(fā),其疾病動態(tài)發(fā)展機制亟需探討。很多學者針對弧菌與對蝦死亡的相互作用展開研究,這對如何有效控制攻毒試驗的風險因素極為重要。在本研究中,Cox比例風險模型首次應用于水產(chǎn)動物疾病學研究,有效分析了在弧菌的攻毒試驗中對蝦動態(tài)生存情況,并定量描述了弧菌風險因素的影響。預后指數(shù)的建立也為今后攻毒試驗選擇條件提供了指導。主要結果如下：1.采取log-rank檢驗方法對不同弧菌攻毒濃度、不同侵染途徑及不同弧菌菌株作用下的對蝦生存期進行比較,高濃度弧菌攻毒(108cfu/mL)較低濃度弧菌攻毒(107cfu/mL),在更短時間內引起了對蝦持續(xù)大量的死亡現(xiàn)象(P=0.038)；注射攻毒比浸浴攻毒能夠更有效地引發(fā)弧菌感染(P0.05)；相比菌株Vp,菌株Vh對對蝦生存期縮短有更大的影響(P=0.042)。2.注射攻毒導致對蝦死亡的風險是浸浴攻毒的40.4倍(HR=40.4；P=0.000)。高濃度弧菌攻毒組(108cfu/mL)對低濃度弧菌攻毒組(107 cfu/mL)死亡風險比為5.9(HR=5.9,P 0.000)。Vh毒力較強,是Vp毒力的4.8倍(HR=4.8,P0.000)。3.在對蝦攻毒試驗中,侵染方式因素對對蝦生存時間影響最大(β=3.698,P0.05),攻毒劑量因素次之(β=1.778,P0.05),弧菌菌株因素影響最小(β=1.561,P0.05).第二部分研究針對凡納濱對蝦腸道對哈氏弧菌浸浴的組織病理變化及轉錄水平的免疫應答。通過組織切片探究對蝦腸道組織形態(tài)在不同濃度哈氏弧菌(低濃度組1.05×105cfu/mL,中濃度組1.05×106cfu/mL及高濃度組1.05×107cfu/mL)的浸浴攻毒作用下的動態(tài)變化,采用實時熒光定量PCR測定抗脂多糖因子基因(ALF)、對蝦素基因(Pen-4c)和Crustin基因(Cru)以及溶菌酶基因(LZM)、脂肪酸結合蛋白基因(Fabp)等免疫相關基因的表達水平變化,并對腸道及水體中的弧菌數(shù)目及分布情況進行監(jiān)測。主要結果如下：1.浸浴攻毒是弧菌侵染對蝦腸道并引發(fā)感染的有效方式。對蝦腸道的感染程度可分為輕度感染及重度感染。輕度感染主要發(fā)生于低中濃度組的中后期及高濃度組侵染早期,上皮細胞形態(tài)發(fā)生改變,黏膜層開始與固有層分離。重度感染主要發(fā)生于低中濃度組后期及高濃度組中期,上皮細胞完全潰散并脫落,肌層也發(fā)生損傷。隨著弧菌濃度的提高和攻毒時間的延長,中腸組織損傷情況逐漸加重。攻毒后40h內,對蝦腸道組織形態(tài)持續(xù)惡化,未見組織修復。2.腸道受到哈氏弧菌侵染后8-16h,ALF、Pen、Cru及LZM表達量能夠迅速上調,32h后均回落至初始水平(P0.05)。Cru在哈氏弧菌侵染作用下表達量變化最大。Fabp基因32h內各攻毒劑量組表達情況未有極大波動,基本較對照組維持在2-6倍的表達水平,并且總體上并無顯著提高(P0.05)。3.攻毒后,三種攻毒濃度組水體中弧菌均處下降趨勢,未出現(xiàn)弧菌大規(guī)模增殖的現(xiàn)象。在32h后,低、中、高濃度組無顯著性差異并普遍趨于穩(wěn)定：低、中、高攻毒組中,對蝦腸道弧菌在0-8h通過水浴攻毒方式經(jīng)口傳播大量進入對蝦腸道,8h-24h維持穩(wěn)定,16h后腸道弧菌小量下降至32h菌數(shù)回落。
【學位單位】：中國科學院研究生院(海洋研究所)
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S945.49
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 海洋弧菌研究進展
        1.1.1 弧菌簡述
        1.1.2 弧菌病原種類
        1.1.3 對蝦弧菌病的爆發(fā)
    1.2 弧菌與對蝦相互作用
        1.2.1 弧菌侵染
        1.2.2 對蝦防御機制
    1.3 攻毒模型研究
        1.3.1 攻毒劑量的影響
        1.3.2 侵染途徑的影響
        1.3.3 攻毒菌株的影響
        1.3.4 Cox比例風險模型的應用
    1.4 對蝦腸道免疫及哈氏弧菌引發(fā)的腸道損傷研究
        1.4.1 哈氏弧菌
        1.4.2 哈氏弧菌致病機理
        1.4.3 哈氏弧菌致病癥狀
        1.4.4 弧菌侵染對蝦腸道研究進展
    1.5 對蝦組織損傷及修復機制
    1.6 本研究內容和意義
        1.6.1 研究內容
        1.6.2 研究意義
    參考文獻
第二章 基于COX比例風險模型探究弧菌侵染凡納濱對蝦的影響因素
    2.1. 材料與方法
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 培養(yǎng)基及試劑
        2.1.3 菌種與培養(yǎng)
        2.1.4 試驗用蝦及飼養(yǎng)管理
        2.1.5 攻毒實驗
        2.1.6 統(tǒng)計分析
    2.2. 結果分析
        2.2.1 數(shù)據(jù)準備及加工
        2.2.2. 變量PH假定(proportional hazards assumption)分析
        2.2.3. 變量的顯著性檢驗
        2.2.4. Kaplan-Meier生存曲線
        2.2.5. Cox比例風險模型回歸分析
    2.3. 討論
        2.3.1. Cox比例風險模型在水產(chǎn)方面的應用前景
        2.3.2. 風險因素對對蝦生存時間的影響
        2.3.3. 預后指數(shù)的建立
    2.4 結論
    參考文獻
第三章 凡納濱對蝦腸道對哈氏弧菌浸浴的組織病理變化及轉錄水平的免疫應答
    3.1. 材料與方法
        3.1.1 實驗儀器
        3.1.2 培養(yǎng)基及試劑
        3.1.3 菌種與培養(yǎng)
        3.1.4 試驗用蝦及飼養(yǎng)管理
        3.1.5 攻毒實驗及取樣
        3.1.6 組織切片制作及觀察
        3.1.7 腸道總RNA提取
        3.1.8 實時熒光定量PCR分析基因表達
        3.1.9 統(tǒng)計分析
    3.2 結果與分析
        3.2.1 組織學分析
        3.2.2 哈氏弧菌攻毒后相關基因表達
        3.2.3 水體及腸道中的弧菌數(shù)目變化
    3.3 討論
        3.3.1 對蝦腸道組織損傷及修復
        3.3.2 對蝦腸道免疫基因表達
        3.3.3 對蝦腸道及水體弧菌數(shù)量變化
    3.4 結論
    參考文獻
致謝
碩士期間發(fā)表期刊及論文
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本文編號：2835711