三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我國特有的淡水育珠蚌,近幾年來淡水珍珠產(chǎn)量的95%都是來自于三角帆蚌。在三角帆蚌的貝殼和珍珠的研究中,鑒定和分析基質(zhì)蛋白的組成和功能對理解其珍珠質(zhì)的形成機理具有非常重要的意義。以前所研究的貝殼基質(zhì)蛋白大都是從海水貝類中分離鑒定的,有關(guān)淡水貝類貝殼基質(zhì)蛋白的研究還比較少。本研究從三角帆蚌外套膜中分離鑒定得到了一個新的貝殼基質(zhì)蛋白基因silkmapin,并對其結(jié)構(gòu)和功能進行了研究。1.對三角帆蚌silkmapin基因進行了克隆、序列分析、結(jié)構(gòu)預(yù)測、組織表達分析及原位雜交檢測。運用RACE技術(shù)得到該基因c DNA序列的全長為1242bp,擁有一個978bp的開放閱讀框。該基因編碼一個30.89KD的蛋白質(zhì),主要含有甘氨酸(Gly),占整個分量的34.41%,序列中所含的天冬氨酸(Asp)主要集中在C末端,推測silkmapin的C末端具有結(jié)合Ca2+的能力。二級結(jié)構(gòu)推測結(jié)果表明silkmapin主要為β折疊,高級結(jié)構(gòu)為一細絲狀蛋白質(zhì)。實時定量PCR結(jié)果表明silkmapin只在外套膜的邊緣外褶和緣膜部的上皮細胞表達。進一步進行原位雜交檢測,結(jié)果與實時定量PCR的結(jié)果一致,在外套膜邊緣和緣膜部的上皮細胞中檢測到了強烈的信號,實時定量PCR和原位雜交的結(jié)果可以說明silkmapin參與了三角帆蚌貝殼珍珠層和棱柱層的形成。2.通過貝殼修復(fù)實驗研究silkmapin在貝殼生物礦化中的作用。將三角帆蚌進行活體破殼處理,破殼的一邊作為實驗組,同時設(shè)有兩個對照組,對外套膜組織和修復(fù)殼樣品進行收集,修復(fù)出的新殼用以進行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察,外套膜組織樣品用以熒光定量表達分析。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示三角帆蚌貝殼生長過程是由外而內(nèi)逐層生長,生長順序依次為角質(zhì)層—棱柱層—珍珠層。薄薄的角質(zhì)層最先完成生長,之后棱柱層文石晶體顆粒在角質(zhì)層表面生長,棱柱層晶體生長是在橫向和縱向兩個方向上同時進行。棱柱層達到成熟后,片狀的正六邊形文石珍珠層晶體在其上開始堆積,從棱柱層生長轉(zhuǎn)向珍珠層時候無明顯的過渡期。還發(fā)現(xiàn)棱柱層生長符合“擠壓假說”的特點,而珍珠層則是典型的“磚墻型”結(jié)構(gòu)。結(jié)合掃描電鏡觀察和在不同時期外套膜中表達的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在棱柱層和珍珠層生長的時期,silkmapin在破殼實驗組中的表達量遠遠高于對照組,說明silkmapin的確參與了三角帆蚌貝殼棱柱層和珍珠層的礦化過程。3.通過插片實驗進一步研究silkmapin在三角帆蚌珍珠形成過程中的作用。選取了健康規(guī)格相同的三角帆蚌進行無核珍珠插核手術(shù),定期進行珍珠囊組織樣品采集和珍珠小顆粒的收集,珍珠囊組織樣品用以進行熒光定量組織表達分析;珍珠小顆粒經(jīng)過處理后放在掃描電子顯微鏡(SEM)下進行表面形貌的觀察。掃描電鏡觀察的結(jié)果表明三角帆蚌珍珠的礦化生長過程分為碳酸鈣無序沉積和有序沉積兩個階段。這兩個階段珍珠顆粒的表面形貌變化也很明顯,從一開始的凹凸不平、雜亂堆積到后來的平整光滑、有序堆疊。結(jié)合電鏡觀察和在不同時期珍珠囊中表達的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)silkmapin在珍珠成核期的表達量呈現(xiàn)一個逐步上升的趨勢,碳酸鈣有序沉積階段的表達量高于無序沉積階段,在珍珠層最初形成期表達量最高。這說明silkmapin在三角帆蚌珍珠礦化的過程起關(guān)鍵的調(diào)控作用,既參與了珍珠質(zhì)形成必不可少的碳酸鈣成核過程,也調(diào)控了珍珠層文石小片的生長堆疊。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

角質(zhì)層處于最外側(cè)，棱柱層位于中間，珍珠層在最里邊。在掃描電子顯微鏡下觀察棱柱層的表面，呈現(xiàn)出不規(guī)則多邊形的長柱狀晶體結(jié)構(gòu)，猶如皮革的紋理（圖1.1）。珍珠層在電子掃描顯微鏡下呈現(xiàn)出的是規(guī)則的六邊形片狀晶體，小片與小片相連，并成層狀堆積的態(tài)勢（圖 1.1）。

表 2-1：silkmapin 的氨基酸組成Table 2-1：Amino acid composition of silkmapinAmino acid Number Percent of totalamino acidsGly 107 34.41Val 26 8.36Ser 24 7.72Phe 18 5.79Thr 18 5.79Pro 17 5.47Tyr 17 5.47Ala 16 5.14Asp 14 4.5Leu 10 3.22Ile 10 3.22Arg 8 2.57Asn 6 1.93Lys 5 1.61Gln 3 0.96Met 3 0.96

圖 2-2：silkmapin 的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，主要以 β 折疊為主Fig.2-2：Secondary structure prediction of silkmapin, folding mainly β
【共引文獻】

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本文編號：2835718