【摘要】：自Wolf和Quimby在1962年建立第一個(gè)永生細(xì)胞系,即虹鱒魚(yú)(Onchorynchus mykiss)性腺細(xì)胞系RTG-2,隨后越來(lái)越多的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系被陸續(xù)建立。截止到2011年,全世界報(bào)道的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系已有275株,但性腺來(lái)源的體細(xì)胞系和肌肉來(lái)源細(xì)胞系十分稀少。魚(yú)類(lèi)性腺體細(xì)胞主要包括卵巢的間質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞,以及精巢的Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞等。性腺體細(xì)胞系對(duì)于生殖細(xì)胞正常的分裂、分化和性腺組織的結(jié)構(gòu)組成等方面具有決定性的作用,尤其是近幾年對(duì)于生殖干細(xì)胞研究的熱潮,使得性腺體細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為發(fā)展必然。肌肉是魚(yú)類(lèi)主要的食用組織,而肌肉細(xì)胞系的建立則為進(jìn)一步研究魚(yú)類(lèi)肌肉的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育提供了平臺(tái),也有助于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)快速生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究和應(yīng)用。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系已廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)、遺傳學(xué)、基因調(diào)控和功能分析、生理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、資源保護(hù)等領(lǐng)域。因此,開(kāi)展魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞系建立的研究具有深遠(yuǎn)意義。魚(yú)類(lèi)性別決定和性腺分化機(jī)制研究一直是熱點(diǎn),而相關(guān)的表觀遺傳修飾-DNA甲基化對(duì)其調(diào)控作用研究還處于起步階段。無(wú)論在海水魚(yú)還是淡水魚(yú)中,對(duì)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因dnmt3的研究十分匱乏,環(huán)境因子如溫度、外源激素等對(duì)于甲基化模式的影響更是知之甚少。而dmrt1基因被認(rèn)為是迄今唯一保守的性別相關(guān)基因,近年來(lái)其在各種魚(yú)類(lèi)雌雄個(gè)體差異表達(dá)譜研究較多,但其甲基化表觀遺傳修飾在性腺分化中的研究報(bào)道還很薄弱。褐牙鲆(Paralichthys olivaceus),是名貴的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種,在相同養(yǎng)殖成本下,雌性個(gè)體比雄性個(gè)體生長(zhǎng)快、體積大,因而其性別決定和分化是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。然而由于缺少合適的性腺細(xì)胞系,其性別相關(guān)形成機(jī)制尤其是細(xì)胞水平的機(jī)理幾乎還是空白。且研究證明褐牙鲆三倍體生長(zhǎng)明顯快于二倍體,2010年已成功實(shí)現(xiàn)褐牙鲆三倍體誘導(dǎo)并達(dá)到批量化,然而到目前為止,還沒(méi)有關(guān)于褐牙鲆三倍體肌肉生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的任何研究進(jìn)展,更沒(méi)有褐牙鲆三倍體肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)的任何研究報(bào)道。本研究首先建立、鑒定了褐牙鲆精巢、卵巢、三倍體褐牙鲆肌肉3個(gè)細(xì)胞系,并分別對(duì)其進(jìn)行外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,以期將這3種細(xì)胞系作為體外遺傳操作模型運(yùn)用于外源基因載體的應(yīng)用研究。同時(shí),克隆得到褐牙鲆甲基轉(zhuǎn)移酶基因dnmt3a和dnmt3b的cDNA全長(zhǎng)。利用雌核發(fā)育褐牙鲆幼魚(yú)為材料,通過(guò)28oC、雌二醇處理,獲得遺傳雌性(XX)表型雄性或雌性的褐牙鲆。之后檢測(cè)了dnmt3a和dnmt3b保守區(qū)域與dmrt1在雌二醇刺激和性逆轉(zhuǎn)褐牙鲆的表達(dá)關(guān)聯(lián),以期探討甲基化作用對(duì)雄性相關(guān)基因dmrt1的調(diào)控作用。具體內(nèi)容及研究結(jié)果如下:褐牙鲆精巢細(xì)胞系、卵巢細(xì)胞系,分別命名為POSC和POOC,目前分別傳代到55代和34代。兩細(xì)胞系都用DMEM/F12基本培養(yǎng)基,FBS添加量為20%,對(duì)于EGF生長(zhǎng)因子POSC添加15 ng/ml,POOC添加20 ng/ml。POSC和POOC主要細(xì)胞類(lèi)型均為成纖維樣;線粒體707bp COI序列分析結(jié)果與NCBI褐牙鲆COI序列一致性為99%,證明2種細(xì)胞系均來(lái)自于褐牙鲆;染色體分析顯示POSC和POOC染色體眾數(shù)都為48,都具有褐牙鲆正常二倍體核型;精巢支持細(xì)胞特異抗體Fas-L免疫組化實(shí)驗(yàn)證明POSC主要為精巢支持細(xì)胞,POOC對(duì)卵巢間質(zhì)特異抗體P450SCC和3β-HSD反應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性,證明POOC為卵巢間質(zhì)細(xì)胞;脂質(zhì)體2000分別成功將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到POSC和POOC細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染效率分別為10%和15%,說(shuō)明2種細(xì)胞系均適宜作為有效的外源基因轉(zhuǎn)化載體,都有望應(yīng)用于體外遺傳操作。三倍體褐牙鲆骨骼肌肌肉細(xì)胞系命名為POMSCS(3n),經(jīng)過(guò)一年的時(shí)間目前已傳代66代。POMSCS(3n)適宜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MEM,添加20%FBS。其細(xì)胞類(lèi)型主要為梭形或紡錘體樣;染色體分析顯示POMSCS(3n)的染色體眾數(shù)為72,具有褐牙鲆正常三倍體核型;肌衛(wèi)星特異標(biāo)記基因pax7b RT-PCR擴(kuò)增和Desmin特異抗體免疫組化實(shí)驗(yàn)均證明POMSCS(3n)為骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞;通過(guò)利用含2%馬血清的分化培養(yǎng)基DM誘導(dǎo)POMSCS(3n)細(xì)胞分化,再利用DAPI染核發(fā)現(xiàn),分化組(DM培養(yǎng)基)相對(duì)于對(duì)照組(GM培養(yǎng)基)含有較多的2核甚至3-4核的多核纖維樣細(xì)胞,證實(shí)POMSCS(3n)細(xì)胞具有分化潛能,且分化能力強(qiáng);同樣脂質(zhì)體2000成功將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到該細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染效率高達(dá)20%,說(shuō)明該細(xì)胞系適宜成為有效的外源基因載體,有望成為遺傳操作的有利工具。克隆獲得褐牙鲆dnmt3a和dnmt3b基因cDNA全長(zhǎng),分別得到dnmt3a基因4個(gè)轉(zhuǎn)錄本,dnmt3b基因3個(gè)轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄本之間相似性較高,都具有甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域PWWP。以雌核發(fā)育褐牙鲆幼魚(yú)為材料,通過(guò)雌二醇(E2)和高溫28oC處理分別得到100%遺傳雌表型雌褐牙鲆和100%遺傳雌表型雄性逆轉(zhuǎn)褐牙鲆,與預(yù)期結(jié)果一致。分析E2處理和28oC處理?xiàng)l件下,dmrt1與dnmt3a和dnmt3b表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)dmrt1與dnmt3a和dnmt3b表達(dá)有關(guān)聯(lián),且dnmt3a與dmrt1關(guān)系更為密切,暗示雄性相關(guān)基因dmrt1基因表達(dá)受甲基轉(zhuǎn)移酶影響,進(jìn)一步推測(cè)褐牙鲆性別決定和分化過(guò)程受甲基化作用調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4
【圖文】：

X/XY 性別決定系統(tǒng)魚(yú)類(lèi)的性別決定和性腺（精巢或卵巢）分化示意圖 (梅潔和桂建Fig1-1 Diagram of sex determination and gonad (testis or ovary) differentiation for fiswith XX/XY sex-determining system

圖 1-2 魚(yú)類(lèi)溫度依賴(lài)型性別決定模式2 Patterns of temperature-dependent sex determination (TSD) in fish (Ospina-Alvarez et al.

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本文編號(hào)：2719814