【摘要】：雌激素是一種性類固醇激素,在動物體內(nèi)發(fā)揮著十分重要的生理作用,主要是通過雌激素受體來介導(dǎo)發(fā)揮其相應(yīng)的雌激素功能。性腺發(fā)育是由眾多調(diào)控因子共同作用完成的,其中雌激素及其受體已經(jīng)被認為是卵巢發(fā)育的重要調(diào)控因子中的一部分。在無脊椎動物中卻未發(fā)現(xiàn)雌激素受體(estrogen receptor, ER)的存在,卻存在另一個同源性極高的基因,故而命名為雌激素相關(guān)受體(estrogen related receptor, ERR)。但目前在甲殼動物發(fā)育過程中對雌激素相關(guān)受體的研究尚未有過多報道,因此對此類核受體的研究更有利于闡述雌激素參與其上下游的信號通路。本文擬用羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)作為該研究的實驗用蝦,展開了對雌激素相關(guān)受體的相關(guān)研究。利用同源克隆的方法以及RACE技術(shù),克隆得到了羅氏沼蝦雌激素相關(guān)受體的cDNA全長,使用半定量PCR(SqRT-PCR)的方法檢測ERR在雌雄個體中組織分布,利用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測不同濃度壬基酚暴露以及不同時間處理對羅氏沼蝦雌蝦卵巢中ERR mRNA表達量的影響。采用生物信息學(xué)方法分析ERR基因開放閱讀框序列、保守區(qū)和同源性等,并構(gòu)建原核表達載體pET-32a-ERR,使用鎳柱親和層析表達產(chǎn)物從而純化目的蛋白。主要研究結(jié)果如下：1.羅氏沼蝦ERR基因的cDNA克隆及序列分析羅氏沼蝦ERR基因的cDNA序列全長為1897 bp,包含了一段長1374 bp的開放閱讀框(ORF),143 bp的5’-UTR和380 bp的3'-UTR,編碼了457個氨基酸殘基,分子量50.75 kDa。氨基酸序列分析表明,羅氏沼蝦雌激素相關(guān)受體含有核受體家族典型的結(jié)構(gòu)域。2.羅氏沼蝦ERR基因的組織表達差異研究組織分布結(jié)果表明,ERR在雌蝦心臟和卵巢中表達量較高,在腦神經(jīng)節(jié)和肝胰腺中信號較弱,而在眼柄、肌肉和鰓中未見表達：ERR在雄蝦心臟中表達量較高,在腦神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、精巢、鰓中表達量較低,而在眼柄和肌肉中亦未見明顯信號,推測ERR可能在卵巢發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。3.壬基酚對羅氏沼蝦ERR mRNA表達的影響用不同濃度NP(5,25和125μg/L)在體暴露羅氏沼蝦兩周后,發(fā)現(xiàn)所有處理組均能顯著促進卵巢ERR mRNA的表達(P0.05),當處理濃度超過25μg/L時,壬基酚發(fā)揮的雌激素效應(yīng)將維持穩(wěn)定；以25μg/L的NP在體暴露羅氏沼蝦,數(shù)據(jù)分析顯示,NP暴露6天時ERR mRNA的表達量已有顯著增加,隨著處理時間的增加,ERR mRNA的表達量均能極顯著提高,其中18天達到峰值,盡管18天后依然相對于對照組ERR表達量顯著增加,但是雌激素效應(yīng)稍有下調(diào)趨勢。4.ERR基因的原核表達與純化將ERR基因ORF序列克隆至原核表達載體pET-32a中,構(gòu)建了重組表達載體pET-32a-ERR,經(jīng)過條件優(yōu)化,最終在溫度為37 ℃, 0.1mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)時間為4 h,搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200 rpm的條件下對目的蛋白進行大量誘導(dǎo)表達,表達產(chǎn)物經(jīng)純化、SDS-PAGE檢測,獲得與預(yù)期大小相符的70 kDa重組蛋白。綜上所述,本文對羅氏沼蝦ERR基因進行了初步研究,并探索了環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對其表達調(diào)控作用；建立了原核表達體系,并獲得ERR蛋白,為下一步目的蛋白的功能驗證,多克隆抗體的制備等研究奠定了基礎(chǔ),為研究ERR在羅氏沼蝦發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2656800