象草(Pennisetum purpureum)是禾本科狼尾草屬的多年生大型草本植物,是優(yōu)良飼用牧草及新型能源植物。但其體內過高的木質素含量限制了象草的開發(fā)與利用。所以,利用基因工程的方法,降低象草木質素含量或改變木質素組成對象草的利用具有重要意義。MYB轉錄因子及肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoy-CoA Reductase,CCR)基因啟動子都參與了木質素的生物合成調控。本文研究了象草抑制型PpMYB4轉錄因子(登錄號為:KU612217)與PpCCR啟動子互作關系,以期為象草的木質化改良工作奠定基礎。主要的研究結果如下:(1)構建了一個以LUC以及REN為報告基因的雙熒光素酶報告檢測PpCCRPro-LUC載體和PpMYB4-SK載體,通過瞬轉煙草后測定熒光值發(fā)現(xiàn)PpMYB4與PpCCR啟動子(PpCCRPro)有明顯的互作,且能抑制了PpCCRPro的活性。(2)通過構建PpCCRPro啟動GUS報告基因的表達載體PpCCRPro-GUS和pBA-PpMYB4載體,并瞬轉煙草,測定GUS酶活發(fā)現(xiàn),PpMYB4與PpCCRPro有明顯的互作,且抑制了PpCCRPro的活性。(3...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮寫表
1 前言
    1.1 能源植物象草的研究進展
    1.2 木質素的基本結構
    1.3 木質素合成的調控
        1.3.1 木質素生物合成關鍵酶基因的調控
        1.3.2 環(huán)境因子及轉錄因子對木質素合成調控
    1.4 轉錄因子
        1.4.1 轉錄因子的結構特征
        1.4.2 轉錄因子MYB研究進展
        1.4.3 MYB對木質素合成的調控
    1.5 植物啟動子與轉錄因子互作研究方法
        1.5.1 雙熒光素酶報告基因檢測
        1.5.2 瞬時表達分析
        1.5.3 EMSA實驗
        1.5.4 染色質免疫共沉淀實驗
    1.6 研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 菌種和質粒
        2.1.3 主要試劑、試劑盒及來源
        2.1.4 主要試劑配置
    2.2 方法
        2.2.1 PpMYB4-SK載體的構建
            2.2.1.1 目的片段的克隆
            2.2.1.2 PCR產物回收
            2.2.1.3 PCR產物的酶切與連接
            2.2.1.4 大腸桿菌Top10感受態(tài)制備
            2.2.1.5 重組載體的轉化
            2.2.1.6 重組載體的菌落PCR鑒定
            2.2.1.7 質粒提取
            2.2.1.8 重組質粒雙酶切的鑒定
        2.2.2 PpCCRPro-LUC載體的構建
            2.2.2.1 目的片段的克隆
            2.2.2.2 酶切、連接與轉化
            2.2.2.3 重組質粒的鑒定
        2.2.3 雙熒光雙熒光素酶報告基因檢測研究
            2.2.3.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.3.2 凍融法轉化農桿菌EHA105
            2.2.3.3 準備注射煙草葉片
            2.2.3.4 煙草葉片的注射
            2.2.3.5 檢測煙草葉片相對熒光值
        2.2.4 瞬時表達載體的農桿菌轉化
            2.2.4.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.4.2 凍融法轉化農桿菌EHA105
        2.2.5 瞬時表達分析
            2.2.5.1 準備煙草葉片注射
            2.2.5.2 煙草葉片的注射
            2.2.5.3 GUS酶活性測定
        2.2.6 凝膠遷移率實驗（EMSA）
            2.2.6.1 PpMYB4表達載體的轉化
            2.2.6.2 小量表達與鑒定
            2.2.6.3 蛋白大量表達及破菌檢測
            2.2.6.4 包涵體蛋白純化
            2.2.6.5 包涵體蛋白復性
            2.2.6.6 復性蛋白純化
            2.2.6.7 DNA探針的設計
            2.2.6.8 DNA探針的標記
            2.2.6.9 生物素標記探針標記效率的檢測
            2.2.6.10 EMSA膠的配制及EMSA結合反應
            2.2.6.11 電泳
            2.2.6.12 轉膜及交聯(lián)
            2.2.6.13 化學發(fā)光檢測
        2.2.7 染色體免疫共沉淀（ChIP）實驗載體的構建
            2.2.7.1 目的片段的克隆
            2.2.7.2 酶切、連接與轉化
            2.2.7.3 重組子的鑒定
        2.2.8 煙草的遺傳轉化
            2.2.8.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.8.2 凍融法轉化農桿菌EHA105
            2.2.8.3 煙草葉盤法遺傳轉化
        2.2.9 轉基因煙草的鑒定
            2.2.9.1 DNA提取
            2.2.9.2 PCR鑒定
            2.2.9.3 半定量RT-PCR鑒定
        2.2.10 ChIP實驗
            2.2.10.1 組織固定及交聯(lián)
            2.2.10.2 核酸分離及片段化
            2.2.10.3 預洗滌
            2.2.10.4 免疫沉淀
            2.2.10.5 反交聯(lián)
            2.2.10.6 qPCR檢測富集效率
            2.2.10.7 瓊脂糖凝膠鑒定
        2.2.11 象草PpCCRPro-PpMYB4過表達載體的構建
            2.2.11.1 目的片段的克隆
            2.2.11.2 酶切、連接與轉化
            2.2.11.3 重組子的鑒定
        2.2.12 煙草的遺傳轉化
            2.2.12.1 感受態(tài)EHA105的制備
            2.2.12.2 凍融法轉化農桿菌EHA105
            2.2.12.3 煙草的葉盤法轉化
        2.2.13 轉基因煙草的鑒定
            2.2.13.1 DNA的提取以及PCR鑒定
        2.2.14 木質素含量的測定
            2.2.14.1 木質素標準曲線的繪制。
            2.2.14.2 木質素含量測定
        2.2.15 植物激素處理
        2.2.16 實時熒光定量PCR
            2.2.16.1 總RNA的提取及c DNA第一鏈合成
            2.2.16.2 qPCR實驗
3 結果與分析
    3.1 雙熒光素酶報告基因檢測結果分析
        3.1.1 PpMYB4-SK載體的構建
        3.1.2 PpCCRPro-LUC載體的構建
        3.1.3 雙熒光素酶報告基因檢測互作分析
    3.2 瞬時表達研究分析
        3.2.1 瞬時表達載體農桿菌轉化的鑒定
        3.2.2 瞬時表達GUS酶活性測定
    3.3 凝膠遷移率實驗（EMSA）結果分析
        3.3.1 融合蛋白提取純化結果
        3.3.2 探針標記效率結果
        3.3.3 EMSA檢測結果
            3.3.3.1 PpMYB4蛋白和探針互作檢測結果
            3.3.3.2 PpMYB4蛋白與探針PpCCR-2 競爭檢測結果
    3.4 ChIP實驗結果分析
        3.4.1 HA-pBA002-PpMYB4實驗表達載體的構建
        3.4.2 HA-pBA002-PpMYB4轉基因植株的PCR鑒定
        3.4.3 RT-PCR鑒定
        3.4.4 ChIP-PCR鑒定
    3.5 表達載體PpCCRPro-PpMYB4異源表達分析
        3.5.1 表達載體PpCCRPro-PpMYB4的構建
        3.5.2 轉基因煙草PCR檢測
        3.5.3 RT-PCR鑒定
        3.5.4 轉基因植株表型及木質素含量的測定
        3.5.5 木質素合成相關基因的測定
        3.5.6 激素對木質素合成相關基因的影響
4 討論
    4.1 PpCCRPro與PpMYB4轉錄因子互作研究
        4.1.1 雙熒光素報告基因檢測的研究
        4.1.2 瞬時表達分析研究
        4.1.3 凝膠遷移率實驗（EMSA）研究
        4.1.4 染色質免疫共沉淀（ChIP）研究
    4.2 PpCCRPro-PpMYB4在煙草中過表達研究
5 結論
致謝
參考文獻
附錄A 引物表
附錄B 標準曲線
附錄C EMAS探針序列



本文編號：3852338