蛋白泛素化修飾是一種在真核生物多種生理過程中發(fā)揮重要作用的翻譯后修飾形式,是靠E3泛素連接酶對關鍵基因的精確識別來實現(xiàn)其功能的多樣性和特異性。研究表明,在植物低磷脅迫應答相關的根系形態(tài)建成、磷吸收轉運以及激素代謝等過程中蛋白泛素化修飾都發(fā)揮了非常重要的調控作用。本研究以橡膠樹組培苗為材料構建了地上部地下部均一化酵母雙雜交cDNA文庫,以前期通過抑制差減雜交(SSH)獲得的2個低磷脅迫應答相關的E3泛素連接酶基因HbSIN4T2、HbTIR1構建誘餌載體,并通過酵母雙雜交技術分別篩選了互作蛋白。繼而克隆獲得互作蛋白的cDNA全長,并通過生物信息學對互作蛋白進行了分析,以期探索這些E3泛素連接酶基因在橡膠樹低磷脅迫應答中的調控作用。主要的研究成果如下:1.構建了橡膠樹地上部均一化cDNA文庫,文庫滴度8×107cfu/mL,所得文庫插入片段≥0.5 kb的重組率為100%;2.構建了橡膠樹地下部均一化cDNA文庫,文庫滴度7×107cfu/mL,所得文庫插入片段≥0.5 kb的重組率為87%;3.構建了兩個與低磷脅迫應答相關的E3泛素連接酶誘餌載體HbSIN4T2、HbTIR1;4.利用酵母...

【文章頁數】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１橡膠樹地上部（Ａ）和地下部（Ｂ）總ＲＮＡ??

膠樹低磷脅迫相關Ｅ３泛素連接酶底物的篩３結果與分析??部地下部均一化酵母雙雜交ｃＤＮＡ和地下部總ＲＮＡ的提取??續(xù)實驗要求的ｍＲＮＡ，總ＲＮＡ的質ＣＴＡＢ法（淦國英等，２００９；郭秀蓮等，ＲＮＡ。然后通過１．２％瓊脂糖凝膠電泳ｒＲＮＡ和２８ＳｒＲＮＡ條帶清楚（圖丨），ＲＮＡ沒有降....

圖２地上部（Ａ）地下部（Ｂ）均一化之后（１）和均一化之前（２）的ｃＤＩＮＡ檢測結果??Ｎｋｅｒ

３．１．３?ｄｓ－ｃＤＮＡ的合成及ＤＳ＿—化效果??以３．０ｐＬｍＲＮＡ反轉錄合成第一鏈，然后經兩輪ＬＤ－ＰＣＲ擴增后，電泳檢測結??果顯示ｄｓ－ｃＤＮＡ呈彌散狀，片段分布較廣，且豐度各異（圖２）。由此表明，大小??不一和豐度各異的ｍＲＮＡ都得到了預期的反轉錄和擴增。??ｄｓ－ｃ....

圖３地上部（１和２）和地下部（３和４）均一化前后１８ＳｒＲＮＡ表達豐度變化檢測??＿

用管家基因１８Ｓ?ｒＲＮＡ分別對地上部和地下部ＤＳＮ均一化前以及均一化并過柱純化??后的ｃＤＮＡ進行擴增檢測。經擴增３０個循環(huán)后，ＤＳＮ均一化處理后的ｃＤＮＡ中，??１８ＳｒＲＮＡ基因的表達豐度均明顯低于均一化之前（圖３）。以上結果表明，均一化??處理有效地降低了高豐度基因，過柱....

圖５地下部均一化文庫的菌落生長情況??－

３．１．４均一化酵母雙雜交文庫構建及質量評價??過柱純化后的ｄｓ－ｃＤＮＡ和線性化質粒ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ共轉化Ｙ１８７感受態(tài)細胞，??轉化后的菌落生長情況如圖４和圖５所示。經統(tǒng)計和計算，初始文庫獨立克隆地上??部為２．２８ｘｌ〇６ｃｆｕ，地下部為２．０４ｘｌ〇６ｃｆｕ，取收集后....

本文編號：4028453