發(fā)布時間：2020-07-02 00:34

【摘要】：熱激蛋白(heat shock proteins,Hsp)是一類受脅迫而誘導(dǎo)大量表達的蛋白質(zhì),普遍存在于植物和動物細胞中。作為分子伴侶的核心成分,Hsp在生長發(fā)育過程中負責蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運和降解,在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近年來,Hsp70被發(fā)現(xiàn)廣泛參與到病毒的侵入、解聚、復(fù)制、運動、基因表達和病毒粒子形成等過程中,但Hsp70與病毒不同組分的互作如何協(xié)同調(diào)控病毒的復(fù)制循環(huán)仍有待深入研究。小熱激蛋白(sHsp)參與病毒侵染的報道較少,多見于動物病毒的研究,sHsp如何調(diào)控植物病毒侵染及其分子機制仍不清楚�；诖�,本研究以甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)為材料,對CP、p23和Hsc70-2三者的互作關(guān)系及其如何調(diào)控病毒侵染進行了較深入地探索,并對Hsp17.6在BBSV侵染中的功能進行了初步分析。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn),Hsc70-2存在于BBSV外殼蛋白(coat protein,CP)和復(fù)制輔助蛋白p23的免疫共沉淀復(fù)合物中,在此基礎(chǔ)上,本研究首先克隆了本生煙(Nicotiana benthamiana)Hsc70-2基因,利用pull-down、雙分子熒光互補(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)和螢火蟲熒光素酶互補成像(LCI)等實驗技術(shù),證明Hsc70-2分別與CP和p23直接互作,而CP和p23之間不存在相互作用,且三者不能通過Hsc70-2形成復(fù)合體。Hsc70-2與CP互作發(fā)生在細胞質(zhì)中且形成較大的聚集體,Hsc70-2與p23互作發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的聚集體中。Pull-down和BiFC結(jié)果表明,CP和p23都結(jié)合Hsc70-2的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain,NBD)。BBSV侵染溫和地誘導(dǎo)Hsc70-2表達上調(diào),超表達Hsc70-2促進BBSV在本生煙中的侵染;相反,下調(diào)Hsc70-2的表達則嚴重影響B(tài)BSV的復(fù)制水平,說明Hsc70-2是BBSV復(fù)制所必需的宿主因子。侵染實驗發(fā)現(xiàn),CP負調(diào)控病毒的復(fù)制,破壞CP的RNA結(jié)合活性,病毒(BBSVmMP/CP△N21)的復(fù)制水平仍顯著低于CP缺失突變體(BBSVmMP/mCP)的復(fù)制水平,說明CP負調(diào)控BBSV的復(fù)制還可能存在其他機制。超表達Hsc70-2能降低CP對病毒復(fù)制的抑制作用,競爭實驗表明CP干擾Hsc70-2與p23間的相互作用,暗示CP的表達會影響病毒復(fù)制復(fù)合體的形成。這些研究結(jié)果表明,BBSV可通過不同組分劫持Hsc70-2這一寄主因子,進而調(diào)控病毒的復(fù)制和侵染,這為深入理解Hsp70家族蛋白在病毒侵染中的不同作用提供了新的視角。本實驗室前期還發(fā)現(xiàn)BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp17.6上調(diào),沉默Hsp17.6則會降低病毒在本生煙中的侵染。在此基礎(chǔ)上,本研究通過熱穩(wěn)定實驗證明HsP17.6確實具有分子伴侶活性,組織特異性表達分析顯示Hsp17.6主要在植物的種子中表達,其次是植物的根和葉。亞細胞定位分析表明Hsp17.6定位于細胞質(zhì),形成大小不一的聚集體且部分聚集體在細胞內(nèi)會發(fā)生移動,有意思的是,BBSV侵染使得Hsp17.6的定位由聚集體形式變?yōu)榫鶆蚍植?結(jié)合BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp90上調(diào)表達、共表達Hsp90引起Hsp17.6發(fā)生類似的定位改變等實驗結(jié)果,我們認為Hsp17.6定位的變化可能是由于BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp90上調(diào)表達而間接引起的。超表達Hsp17.6蛋白并不能促進BBSV的侵染,沉默Hsp17.6減弱BBSV的侵染但不影響病毒的復(fù)制,暗示Hsp17.6可能在病毒的運動中起作用。BiFC和pull-down實驗表明,Hsp17.6與BBSV的運動蛋白p7a存在相互作用;BiFC和Co-IP實驗也證明,Hsp17.6與Actin互作,這些實驗結(jié)果初步表明Hsp17.6可能在介導(dǎo)BBSV運動復(fù)合體沿著Actin的運動中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41
【圖文】：

Ｈｓｐ｜：Ｐｉ邋卜－逡逑Ｉ、人逡逑Ｈ0ｐｔ逡逑Ｈｓｐ９０逡逑圖１－１邋Ｈｓｐ７０的分子伴侶功能循環(huán)模型（Ｍａｙｅｒ，２００５）逡逑當Ｈｓｐ７０結(jié)合ＡＴＰ時，其對底物的親和力較低，有利于折疊至天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)的釋放并快速加載變性的蛋白質(zhì)，逡逑輔助分子伴侶ＪＤＰ促進Ｈｓｐ７０水解ＡＴＰ引起Ｈｓｐ７０構(gòu)象發(fā)生改變，此時Ｈｓｐ７０緊密地結(jié)合底物并進行蛋白質(zhì)的逡逑折疊。在核苷酸交換因子的作用下，Ｈｓｐ７０上ＡＤＰ－ＡＴＰ快速交換，同時使Ｈｓｐ７０回到最初的構(gòu)象，釋放折疊好的逡逑蛋白質(zhì)并開始新的伴侶功能循環(huán)。在輔助分子伴侶Ｈｏｐ的幫肋下，Ｈｓｐ７０可與Ｈｓｐ９０協(xié)同作用促進變性蛋白質(zhì)的逡逑重新折疊。藍色圖形表示Ｈｓｐ７０，黃色線條表示底物蛋白。逡逑許多病毒侵染能誘導(dǎo)宿主細胞大量表達Ｈｓｐ７０邋（Ｃｈｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８ｂ；邋Ｎａｇｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ逡逑ｅｔａｌ．，２００９；Ｙａｏｅｔａｌ．，２０１７），表明Ｈｓｐ７０在病毒侵染中發(fā)揮重要作用。Ａｐａｒｉｃｉｏ等人提出誘導(dǎo)表達逡逑Ｈｓｐ７０可能與病毒ＲＮＡ的復(fù)制不是直接相關(guān)的

Ｈｓｃ７０，缺失ＳＧＴＡ增強ＳＶ４０與Ｈｓｃ７０的親和力，但這不利于ＳＶ４０有效地釋放到細胞質(zhì)中。超逡逑表達ＳＧＴＡ促進Ｈｓｃ７０對底物的結(jié)合從高親和的ＡＤＰ－Ｈｓｃ７０態(tài)向低親和的ＡＴＰ－Ｈｓｃ７０態(tài)的轉(zhuǎn)變，逡逑這不利于病毒粒子結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ｈｓｃ７０，因此也不利于ＳＶ４０高效地釋放到細胞質(zhì)中（圖１－２）。逡逑ＳＧＴＡ如何適時地促進與減弱Ｈｓｃ７０與病毒粒子的親和力尚不清楚。此外，Ｈｓｐｌ０５、Ｈｓｃ７０和Ｊ蛋逡逑白協(xié)同作用組成解聚機器（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋ｍａｃｈｉｎｅｒｙ），負責清理細胞內(nèi)聚集的蛋白質(zhì)，這種解聚逡逑機器可能被ＳＶ４０劫持以促進其進入宿主細胞（Ｒａｖｉｎｄｒａｎｅｔａｌ．，２０１５）。目前尚沒有Ｈｓｐ７０家族蛋逡逑白調(diào)控植物病毒侵入細胞的報道。逡逑１．１．１．２Ｈｓｐ７０調(diào)控病毒的解聚、組裝與釋放逡逑Ｈｓｐ７０在動物病毒的解聚、組裝和釋放等過程中都起重要的作用。在多瘤病毒感染３邋ｈ時，逡逑Ｈｓｐ７０就能與病毒粒子ＶＰ１結(jié)合，同時在體外實驗中，Ｈｓｐ７０以水解ＡＴＰ提供的能量有效地促進逡逑多瘤和乳頭瘤病毒樣顆粒和病毒粒子解聚（Ｃｈｒｏｍｙ邋ｅｔａｌ．，２００６）。Ｉｖａｎｏｖｉｃ等人利用網(wǎng)織紅細胞裂逡逑解物重現(xiàn)完整的５分子的釋放。在這個系統(tǒng)中，用Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０抗體封閉Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０減少了邋５逡逑的釋放

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