【摘要】：植物能夠?qū)θ肭值牟≡w產(chǎn)生防御反應(yīng),包括生物、化學(xué)和物理系統(tǒng)性防御。在生物系統(tǒng)性防御中依賴一類最重要的R(Resistance)基因編碼的R蛋白,它可以特異性識(shí)別特定病原體,以激發(fā)植物的防御反應(yīng)。R基因分為多種類型,其中NBS-LRR類型是植物基因組中最大的基因家族之一,而TIR-NBS-LRR類型的抗病基因又是其中的一大類,包括煙草N基因、擬南芥RPS4基因等。大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是大豆的嚴(yán)重病害,但對(duì)其抗病基因的研究尚屬滯后。大豆GmNH23基因也屬于TIR-NBS-LRR類型,與抗煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的煙草N基因同源,本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用本氏煙草瞬時(shí)過表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證了GmNH23基因?qū)MV和SMV都具有一定的抗性。然而,GmNH23基因在穩(wěn)定過表達(dá)植物中的抗病毒活性及其在大豆中的抗病毒功能尚未進(jìn)行研究。因此本論文從這兩方面對(duì)GmNH23基因的功能做了深入研究。首先,我們得到了GmNH23基因過表達(dá)(GmNH23-Ox)轉(zhuǎn)基因本氏煙草,驗(yàn)證其對(duì)TMV和SMV均具有抗性,進(jìn)一步證實(shí)了GmNH23基因?qū)@兩種病毒的抗性。反式作用小干擾RNA(trans-acting siRNA,tasiRNA)是一類由特異的MicroRNA介導(dǎo)產(chǎn)生的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),能夠通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默來抑制中靶標(biāo)基因的表達(dá)。因此我們利用tasiRNA干擾大豆GmNH23基因的表達(dá)來驗(yàn)證其抗SMV和TMV的功能。本研究利用產(chǎn)生內(nèi)源tasiRNA的miR1514a設(shè)計(jì)并構(gòu)建了干擾載體pKGWRR-tasiRNA-GmNH23。首先通過17wt和rdr6 silence本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)法驗(yàn)證了tasiRNA-GmNH23對(duì)靶標(biāo)基因的沉默作用。然后,分別在GmNH23-Ox本氏煙草、中抗大豆品種合豐55號(hào)、高抗大豆品種科豐1號(hào)葉片中瞬時(shí)表達(dá)tasiRNA-GmNH23,結(jié)合病毒侵染實(shí)驗(yàn)證明了GmNH23對(duì)TMV和SMV的抗性。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化法在豆科植物中被廣泛應(yīng)用。由于siRNA能夠通過維管組織從植物的根部運(yùn)輸?shù)饺~片組織,所以本研究利用毛根轉(zhuǎn)化法在大豆根部表達(dá)了tasiRNA-GmNH23。在高抗大豆品種科豐1號(hào)根組織中表達(dá)的tasiRNA-GmNH23不僅沉默了根組織中GmNH23基因的表達(dá),同時(shí)也降低了葉片中GmNH23基因mRNA的水平。GmNH23基因的沉默導(dǎo)致了葉片中SMV病毒積累量的增加,最終也證明在大豆中GmNH23具有抗SMV的功能。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.2
【圖文】：

BPMV）、煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）、花生斑駁病毒（Peanut mottle virus,CMV）、菜豆黃化花葉病毒（Bean yellow mosaic virus, BYMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）等[2]。其中，大豆花葉病毒病對(duì)大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)均可造成較為嚴(yán)重的危害。由于 SMV 分布廣泛、危害較重、化學(xué)藥劑難以防治，一直都是大豆種植面臨的主要問題。因此，篩選新的抗病種質(zhì)并發(fā)掘新的抗病基因是拓寬大豆抗病遺傳基礎(chǔ)和成功培育抗SMV 品種的關(guān)鍵[1]。SMV 是馬鈴薯 Y 病毒屬中的成員，其基因組是由正義單鏈 RNA 組成，能編碼至少 10種蛋白質(zhì)（圖 1.1）。SMV 分離株在美國(guó)被分為 7 種不同的病毒株（G1 至 G7），而在中國(guó)，SMV 的 21 種病毒株（SC1 至 SC21）已被分類[3]。其中有一些 SMV 株系會(huì)引起大豆較為嚴(yán)重的病征，例如，東北 SMV-N（Necrosis）病毒株系[4]。其傳播方式主要有兩種，其中一種是種子本身帶有病毒；另一種是以昆蟲為介體進(jìn)行傳播。而本研究所用的病毒株是大豆花葉病毒 N1 株，它能使感染的大豆出現(xiàn)較明顯的表征：葉片出現(xiàn)皺縮、卷曲、黃化等癥狀甚至能導(dǎo)致植株的死亡。

來控制[6]。目前，已經(jīng)從幾種模式植物中鑒定出了很多 R 基因碼多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，主要包含跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembranedom白激酶結(jié)構(gòu)域（serine/threonine protein kinases, PKs）、核nding site, NBS）和富含亮氨酸重復(fù)（leucine-rich repeat, LRR）結(jié)構(gòu)域，分別是 NB 結(jié)構(gòu)域和 LRR 結(jié)構(gòu)域即 NBS-LRR 結(jié)構(gòu)于 N 末端結(jié)構(gòu)特征細(xì)分為：白細(xì)胞介素受體-1（Toll InterleukBS-LRR 結(jié)構(gòu)域和包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiledcoil，CC) 的 CC所示）[8]。而每種結(jié)構(gòu)域都有其相應(yīng)的功能。例如， NBS 可以結(jié)合的 ATP 或 ADP 的存在可以確定 R 蛋白是否處于活性或有約 20-30 個(gè)亮氨基酸殘基串聯(lián)重復(fù)序列的基本特征[9]。LRR 能病信號(hào)的傳遞，從而誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)[10]。TIR 在動(dòng)物和植。在植物中，它能感知病原體然后引發(fā)植物的防御反應(yīng)，其中反應(yīng)（hypersensitive response，HR）[11]。

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