【摘要】：煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的單組分病毒,經(jīng)煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播,在番茄和煙草上可引起嚴(yán)重的曲葉病,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。vsiRNAs(virus-derived small interfering RNAs)介導(dǎo)的RNA沉默主要靶向病毒自身基因組和寄主的mRNA對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。本試驗(yàn)以本氏煙(Nicotiana benthamiana)為試驗(yàn)材料,研究TbCSV及其伴隨衛(wèi)星(Tobacco curly shootβsatellite,TbCSB)病害復(fù)合體來(lái)源的vsiRNAs在病毒侵染過(guò)程中的作用,試驗(yàn)結(jié)果將有助于解析TbCSV/TbCSB誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生典型癥狀的作用機(jī)制。為驗(yàn)證TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染本氏煙后是否產(chǎn)生vsiRNAs,本研究利用小RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染后本氏煙、TbCSV單獨(dú)侵染后本氏煙進(jìn)行小RNA測(cè)序分析,結(jié)果顯示,TbCSV/TbCSB處理組中共測(cè)得1165882條vsiRNAs,特異的有87315條;TbCSV處理組中共測(cè)得217272條vsiRNAs,特異的有32192條。在兩組處理中來(lái)源于TbCSV和TbCSB的vsiRNAs大小均主要為21 nt和22 nt,主要分布于TbCSV和TbCSB編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)內(nèi),且首位堿基主要為尿嘧啶(Uracil,U)。對(duì)vsiRNAs的產(chǎn)生熱點(diǎn)分析顯示,TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染的TbCSV基因組上共有55個(gè)熱點(diǎn),在TbCSB上共有17個(gè)熱點(diǎn);TbCSV單獨(dú)侵染的TbCSV基因組上共有49個(gè)熱點(diǎn)。本試驗(yàn)選取了55個(gè)reads數(shù)超過(guò)2000的來(lái)源于TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染的TbCSV來(lái)源的vsiRNAs與各個(gè)基因mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行比對(duì),得到19個(gè)來(lái)源于TbCSV mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA。進(jìn)一步利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得14個(gè)vsiRNAs。為了驗(yàn)證病毒產(chǎn)生的vsiRNAs是否在病毒侵染過(guò)程中起作用,我們將驗(yàn)證得到的14個(gè)vsiRNAs分別構(gòu)建至甘藍(lán)曲葉病毒(Cabbage leaf curl virus,CaLCuV)表達(dá)載體(pCVA)中,經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)在本氏煙體內(nèi)表達(dá),分析vsiRNAs表達(dá)后對(duì)本氏煙植株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示,其中有3個(gè)vsiRNAs表達(dá)后造成本氏煙生長(zhǎng)異常,分別命名為Y35A8、Y35A14、Y35A18。Y35A8表達(dá)后本氏煙葉片向下卷曲并有黃脈癥狀;Y35A14表達(dá)后本氏煙心葉嚴(yán)重向下卷曲且伴有黃脈癥狀,下部葉片也有輕微黃脈癥狀;Y35A18表達(dá)后本氏煙上整個(gè)頂部葉片卷曲并有黃脈癥狀。為進(jìn)一步研究vsiRNA Y35A8、Y35A14、Y35A18表達(dá)后對(duì)病毒侵染的影響,分別在這3個(gè)小RNA表達(dá)15 d后接種TbCSV/TbCSB侵染性克隆,接種8 d和45 d后,觀察本氏煙的表型變化,并用qPCR方法分析病毒積累量。結(jié)果顯示,與未表達(dá)vsiRNA植株相比較,表達(dá)這3個(gè)vsiRNA的本氏煙上病毒癥狀更加嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的葉片卷曲以及莖稈扭曲;qPCR檢測(cè)病毒積累量,結(jié)果顯示,在表達(dá)Y35A8的本氏煙上,病毒積累量比對(duì)照組高而衛(wèi)星積累量比對(duì)照組低;在表達(dá)Y35A14的本氏煙上,病毒和衛(wèi)星的積累量均比對(duì)照組高;在表達(dá)Y35A18的本氏煙上,病毒積累量前期比對(duì)照組高而后期比對(duì)照組低,衛(wèi)星積累量前期比對(duì)照組高而后期與對(duì)照組基本一致。以上結(jié)果說(shuō)明病毒來(lái)源的vsiRNAs在病毒侵染過(guò)程中對(duì)寄主和病毒都產(chǎn)生了影響。為了研究Y35A8、Y35A14、Y35A18是否靶向寄主mRNA從而行使功能,我們結(jié)合psRNATarget靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站和RT-qPCR方法驗(yàn)證到有4個(gè)靶基因符合小RNA負(fù)調(diào)控,表達(dá)下調(diào);分別命名為Y35A8-6、Y35A14-2、Y35A14-3、Y35A18-8。靶基因Y35A8-6 ID為Niben101Scf04410g04006.1,屬于蛋白酶抑制子家族基因;靶基因Y35A14-2 ID為Niben101Scf23557g00007.1,屬于亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶基因家族基因;靶基因Y35A14-3 ID為Niben101Scf03194g01005.1,為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因;靶基因Y35A18-8 ID為Niben101Scf03009g05001.1,為富亮氨酸重復(fù)序列家族基因。我們進(jìn)一步利用煙草脆裂病毒(Tabacco rattle virus,TRV)介導(dǎo)這4條基因下調(diào)表達(dá)從而研究其對(duì)寄主和病毒的影響。結(jié)果顯示,分別將這4條基因沉默后的處理組植株的表型與對(duì)照組植株相比沒(méi)有差異;基因沉默10 d后繼續(xù)接種TbCSV/TbCSB第10 d,基因Y35A8-6、Y35A18-8處理組上病毒侵染會(huì)造成頂端葉片卷曲較對(duì)照嚴(yán)重,基因Y35A14-2、Y35A14-3處理組上與對(duì)照相比表型沒(méi)有差異;qPCR結(jié)果顯示,處理組中TbCSV和TbCSB的積累量均比對(duì)照要低。以上研究表明,TbCSV/TbCSB侵染本氏煙后產(chǎn)生vsiRNAs,且部分vsiRNAs會(huì)影響寄主的正常生長(zhǎng)和協(xié)助病毒侵染并造成較嚴(yán)重癥狀,以及增強(qiáng)病毒在寄主中的積累量,表明其可能參與了病毒與寄主的互作過(guò)程。此外,qPCR分析得到的4條靶基因下調(diào)表達(dá)后導(dǎo)致病毒和衛(wèi)星的積累量降低,表明其對(duì)病毒的侵染和復(fù)制也造成了影響。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.72

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2737407