【摘要】：已有很多文獻(xiàn)指出保護(hù)性動(dòng)物的抗菌耐藥性(Antimicrobialresistance,AMR)和致病因子(Virulence factors)對(duì)于公共衛(wèi)生安全的影響日益重要�，F(xiàn)在臨床上關(guān)于細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測與關(guān)注還不夠深入、全面,對(duì)于細(xì)菌耐藥性研究還沒有形成完整的理論基礎(chǔ)。穿山甲是目前國際上野生動(dòng)物保護(hù)極為關(guān)注的物種類群之一,因其獨(dú)特的藥用特性,長期受到盜獵和非法販賣,甚至是跨境走私。然而目前在全世界范圍內(nèi),對(duì)穿山甲的飼養(yǎng)還處于探索階段,穿山甲經(jīng)�；加懈鞣N疾病,對(duì)其治療的效果也不明顯。本文對(duì)廣西壯族自治區(qū)陸生野生動(dòng)物救護(hù)研究與疫源疫病監(jiān)測中心收治的一些馬來穿山甲疑似出血性肺炎病例進(jìn)行測序、檢測、分析,研究其攜帶的致病菌及耐藥性,現(xiàn)將結(jié)果匯總?cè)缦?第一部分基于高通量測序進(jìn)行馬來穿山甲疑似出血性肺炎致病菌篩查目的為馬來穿山甲出血性肺炎致病菌的篩查提供良好的基因組數(shù)據(jù)參考,明確導(dǎo)致穿山甲疑似出血性肺炎發(fā)病的病原微生物,為其疾病的防治研究奠定基礎(chǔ)。方法本研究通過采集疑似出血性肺炎死亡馬來穿山甲的肺部組織和非肺炎死亡的穿山甲肺部組織,全部組織分別提取DNA,并將疑似肺炎死亡的馬來穿山甲肺部組織進(jìn)行全基因組測序分析。對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析篩選,利用PCR在疑似肺炎和非肺炎死亡馬來穿山甲的肺部組織中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果我們?cè)?6例宏基因組測序的疑似肺炎死亡馬來穿山甲肺部組織樣本中,發(fā)現(xiàn)了37種細(xì)菌的存在,其中出現(xiàn)頻率較高的是假單胞菌屬(Pseudomonas),葡萄球菌屬(Staphylococcus),芽孢桿菌屬(Bacillus),鏈球菌(Streptococcus),梭狀桿菌屬(Clostridium),支原體屬(Mycoplasma),螺原體屬(Spiroplasma),脲原體屬(Ureaplasma),棒狀桿菌屬(Corynebacterium),乳酸菌屬(Lactobacillus),乳球菌屬(Lactococcus),腸球菌屬(Enterococcus),變形桿菌屬(Proteus),摩氏摩根菌屬(Morganella)等。對(duì)樣本中出現(xiàn)頻率較高且與肺炎相關(guān)的6種細(xì)菌的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,在疑似出血性肺炎和非肺炎死亡的馬來穿山甲肺部組織中都檢測到了假單胞菌屬和芽孢桿菌屬,而葡萄球菌屬、鏈球菌屬、梭狀桿菌屬、摩氏摩根菌屬只存在于疑似出血性肺炎死亡的馬來穿山甲肺部組織中。結(jié)論通過對(duì)全基因組測序分析及PCR驗(yàn)證,在馬來穿山甲疑似出血性肺炎樣本中發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)菌,我們推斷馬來穿山甲死亡的病因存在多種致病菌的協(xié)同作用。為了進(jìn)一步明確該批馬來穿山甲患病的病因,我們?nèi)孕鑼?duì)其進(jìn)行更加深入的研究與探索。第二部分馬來穿山甲疑似出血性肺炎相關(guān)優(yōu)勢菌株的篩選及耐藥性分析目的進(jìn)一步驗(yàn)證以上的研究結(jié)果,實(shí)施針對(duì)性的檢測,取得更詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),支持臨床上的工作。方法通過重新收集救護(hù)期間疑似出血性肺炎死亡的的馬來穿山甲個(gè)體,采集病死馬來穿山甲的肺部樣本進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)純化分離、細(xì)菌16s r DNA通用引物PCR測定等,將所得細(xì)菌PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行基因組測序。細(xì)菌PCR測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)以確定細(xì)菌種類。另外,對(duì)以上培養(yǎng)純化分離的兩種細(xì)菌的菌液通過DNA小片段文庫測序(PE150),拼接組裝后進(jìn)行耐藥基因的分析,探討病原菌的耐藥性。結(jié)果對(duì)采集新死亡的5只疑似出血性肺炎死亡馬來穿山甲的肺部組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離,均得到葡萄球菌屬,主要為金黃色葡萄球菌。結(jié)合臨床治療效果,我們選擇兩株優(yōu)勢菌(溶血性葡萄球菌和金黃色葡萄球菌)進(jìn)行全基因組測序。對(duì)耐藥基因分析發(fā)現(xiàn),這兩種菌株攜帶有很多類型的抗生素耐藥基因(包括萬古霉素、替考拉寧、桿菌肽、枯草桿菌抗生素、鈉類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯物、林肯(酰)胺、鏈菌素b等)。同時(shí),臨床治療也發(fā)現(xiàn),對(duì)攜帶有這些抗生素耐藥基因的個(gè)體使用相應(yīng)的抗生素治療效果不理想。結(jié)論根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果,葡萄球菌屬在疑似出血性肺炎死亡的馬來穿山甲肺部組織屬于優(yōu)勢菌群,尤其是金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌溶血性葡萄球菌攜帶很多類型的抗生素耐藥基因,這些結(jié)果為馬來穿山甲的疾病防治提供重要的基礎(chǔ)資料。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R563.1;R446.5
【圖文】：

圖 1-1 高通量測序篩選出的 37 個(gè)細(xì)菌的頻率與豐度圖Fig. 1-1 The frequency and abundance for 37 bacteria from metagenome sequencing3.3 PCR 在穿山甲疑似出血性肺炎組及對(duì)照組中驗(yàn)證為了驗(yàn)證疑似出血性肺炎死亡與非肺炎死亡馬來穿山甲肺部組織中的致病菌與高通量測序篩查菌群分布是否有差別，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們篩選了以上在 37 種菌屬在樣本中出現(xiàn)頻率較高且與出血性肺炎相關(guān)的 6 種菌群（葡萄球菌屬，芽孢桿菌屬，梭狀桿菌屬，鏈球菌屬、假單胞菌和摩氏摩根菌）進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。驗(yàn)證樣本包含以上測序的 16 例疑似出血性肺炎死亡馬來穿山甲肺部組織和 15 例非肺炎死亡馬來穿山甲的肺部組織。首先，提取馬來穿山甲肺部組織 DNA 且將其 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行了電泳，葡萄球菌屬的目的基因片段長度為 484 bp，芽孢桿菌屬的目的基因片段長

圖 1-2 6 種菌群在病例組及對(duì)照組中的檢出率Fig. 1-2 Detection rate of 6 species of bacteria in pathological group and control group圖 1-3 6 種菌群在樣本中的 PCR 檢測注：圖 A1-3 為病例組中的檢測情況，圖 A4-6 為對(duì)照組中的檢測情況，圖 B 為不同細(xì)菌在病例組中的檢測情況，圖 C 為摩氏摩根菌在病例組中的檢測情況Fig. 1-3 Detection of PCR in six species of bacteria in samplesNote: Figure A1-3 is the detection in the case group, Fig. A4-6 is the detection in the control group, Figur Bis the detection of the different bacteria in the case group, Figure C is the detection of the Morganella moriiin the case group.4 討論

出率與高通量測序基本一致。這些檢測結(jié)果表明芽孢桿菌和假單胞菌是穿山甲肺部常見菌屬，而另外 4 種菌屬可能與出血性肺炎相關(guān)。圖 1-2 6 種菌群在病例組及對(duì)照組中的檢出率Fig. 1-2 Detection rate of 6 species of bacteria in pathological group and control group

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