【摘要】：為了適應(yīng)臨床病原微生物檢測(cè)需求,保障國(guó)家公共衛(wèi)生安全,提高人民健康水平,建立能對(duì)病原微生物特征信息進(jìn)行快速、多靶點(diǎn)檢測(cè)且適用于自動(dòng)化平臺(tái)的分子診斷新技術(shù)十分必要,具有非常重要的實(shí)用價(jià)值和社會(huì)意義。致瀉性大腸埃希氏菌在腹瀉菌中占有很大比例,主要是通過污染的食物和水傳播,我國(guó)檢出率較高的地區(qū)主要在山東、福建、河南。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)和生化檢測(cè),這種方法操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),難以滿足臨床檢測(cè)要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法越來越多的應(yīng)用到病原微生物的檢測(cè),但大多方法普遍難以實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化檢測(cè)。本研究旨在結(jié)合多重PCR和編碼磁性微粒的優(yōu)勢(shì),以大腸埃希氏菌(E.coli)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinvasive E.colic,EIEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenic E.colic,EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、出血性大腸埃希氏菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)為檢測(cè)靶標(biāo),建立了一種新型、快速、高通量且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)的方法,從而能夠快速、準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)病原微生物。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面:第一,多重PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建。以腸侵襲性大腸埃希氏菌、腸致病性大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌為檢測(cè)目標(biāo)設(shè)計(jì)了8對(duì)特異性引物和一對(duì)通用引物。對(duì)多重PCR中第一步PCR中的第一階段,即基因特異性引物擴(kuò)增階段的循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,確定12循環(huán)效果更好。調(diào)試了特異性擴(kuò)增階段混合引物中各引物的工作濃度,最后確定uid A、ipaH、stx2、stx1、eae、rfbe、ST、LT的最佳工作濃度分別為0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.8μM。第二,多重PCR結(jié)合基因芯片檢測(cè)方法的研究。針對(duì)4種致瀉性大腸埃希氏菌的靶基因設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的捕獲探針序列、對(duì)照探針序列以及陽性對(duì)照組的互補(bǔ)序列。通過多重PCR和基因芯片技術(shù)聯(lián)用,建立了基因芯片檢測(cè)方法。確定了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的檢測(cè)靈敏度分別為1.3×104 CFU/mL、2×105 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。第三,用構(gòu)建的多重PCR結(jié)合編碼磁性微粒芯片的檢測(cè)方法研究。應(yīng)用編碼磁性微粒芯片檢測(cè)5種大腸埃希氏菌,檢測(cè)特異性好,EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1.3×104 CFU/mL、2×104 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。編碼磁性微粒芯片的單個(gè)菌株檢測(cè)結(jié)果與基因芯片結(jié)果相近,但對(duì)于菌株中的單個(gè)靶分子,大多數(shù)編碼磁性微粒芯片的檢測(cè)靈敏度更高。
【圖文】：

碩士畢業(yè)論文碼磁性微粒及其在生物檢測(cè)中的應(yīng)用碼磁性微粒的特點(diǎn)碼磁性顆粒(Barcoded Magnetic Beads, BMBs) 是由 Winston Ho 等在 2012 年 4 月正式發(fā)布成為商品，屬于美國(guó) AppliedBioCode 公司分別為 70-100 μm、25 μm、6 μm；由順磁性生物相容高分子復(fù)合組裝構(gòu)成，不僅生物相容性好而且分子長(zhǎng)期穩(wěn)定，易于磁分離；工藝，，條形碼制備成本低，且條碼易被準(zhǔn)確掃描，共有 4096 個(gè)可用 4095，從而可以同時(shí)檢測(cè) 4096 個(gè)不同的靶分子，實(shí)現(xiàn)高通量檢發(fā)了 BMB 分析系統(tǒng)：BioCode MD×3000（見圖 1-1）、BioCodee1000A 可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

圖 1-2 編碼磁性微粒工作原理示意圖(a) 基于核酸雜交的檢測(cè)原理；(b) 基于抗原抗體結(jié)合的檢測(cè)原理基于 BMB 的檢測(cè)方法易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)、信號(hào)穩(wěn)定、檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單且能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。近年來 BMB 受到了廣泛的關(guān)注，Zhang 等[60]用編碼磁性微粒技術(shù)檢測(cè)出了人血清中的 30 個(gè)細(xì)胞因子，檢出限小于 5 pg/mL，細(xì)胞因子間和同一細(xì)胞因子內(nèi) CV 均小于 10%，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很好的相關(guān)性。Casen等[61]采用編碼磁性微粒技術(shù)檢測(cè)腸道菌群，針對(duì) 300 種細(xì)菌設(shè)計(jì)了 54個(gè)探針，通過與 165 例健康者細(xì)菌普相比，發(fā)現(xiàn) 73%的腸易激綜合征(IrritableBowel Syndrome, IBS) 腸道菌群微生態(tài)失調(diào)，且深度測(cè)序與實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度相關(guān)。除此之外，據(jù)一些會(huì)議海報(bào)和新聞報(bào)道也有一些科研團(tuán)隊(duì)開始使用編碼磁性微粒技術(shù)來進(jìn)行各種研究，如 AppliedBioCode 公司從 2014 年一直致力于腸道微生物的檢測(cè)，2016 年用高通量 BioCode MD×3000 系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè) 18 種腸道微生物，檢測(cè)限為 102至 105CFU/mL。臺(tái)灣 Sandra Lee 等人用編碼磁性微粒技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HPV(Human Papillomavirus) 的 50 種分型。Cheryl Sesler 等人用這種技術(shù)結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：湖南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R446.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2559738