本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根的誘導(dǎo)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：重金屬鎘(Cd)是生物毒性較強(qiáng)的重金屬元素之一,它會(huì)隨工業(yè)“三廢”排放到土壤中,并且在土壤一植物系統(tǒng)中遷移,因此Cd污染土壤的修復(fù)引起了世界各國(guó)的關(guān)注。利用植物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行Cd污染土壤的修復(fù)具有良好的應(yīng)用潛力,而Cd超富集植物是這一技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。因此加強(qiáng)對(duì)Cd超富集植物的研究是推動(dòng)植物修復(fù)Cd污染環(huán)境實(shí)際應(yīng)用的基礎(chǔ)。本論文選擇生長(zhǎng)快、易獲得的Cd超富集植物油菜(Brassica campestris L.)作為研究材料,選擇編碼谷酰半胱氨酸巰基合成酶(GS)的gshB基因作為外源目的基因,希望利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因的油菜毛狀根體系,為研究植物根系與Cd的相互作用提供簡(jiǎn)便可靠的實(shí)驗(yàn)體系。方法：發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)常用的方法之一,本論文利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌和攜帶gshB基因的發(fā)根農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化油菜,獲得野生型油菜毛狀根和轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根。為了實(shí)現(xiàn)油菜毛狀根的誘導(dǎo)并獲得較高的轉(zhuǎn)化率,利用正交試驗(yàn)(L8(27))的方法,考查了發(fā)根農(nóng)桿菌菌種(ATCC 11325、ATCC 15834)、油菜外植體(子葉、莖段)、侵染時(shí)間(10 min、30min)、激素(2,4-D、NAA)四因素對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響。利用熱激法將構(gòu)建的重組pRI101-gshB質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325中,獲得改造的含有g(shù)shB目的基因的ATCC 11325菌種。利用PCR和RT-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化的毛狀根進(jìn)行鑒定,確定毛狀根轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因rolC和目的基因gshB已經(jīng)整合到油菜毛狀根組織的DNA中。最后對(duì)油菜毛狀根進(jìn)行初步的Cd脅迫應(yīng)激響應(yīng)研究。將轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根和野生型毛狀根分別置于不含Cd和含50 μmol/L Cd的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng),7d后取樣測(cè)定毛狀根的生物量、毛狀根中過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化、丙二醛(MDA)的含量,并且通過(guò)PI染色檢測(cè)Cd脅迫下的植物細(xì)胞膜的通透性。結(jié)果：正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示,菌種和侵染時(shí)間的交互作用、外植體種類(lèi)對(duì)油菜毛狀根的誘導(dǎo)達(dá)到顯著水平。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325對(duì)預(yù)培養(yǎng)48 h的油菜子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化時(shí)間 10 min,同時(shí)加入0.3 mg/L的2,4-D激素時(shí),油菜毛狀根的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到73%。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的rolC基因已經(jīng)插入并整合到油菜的植物基因組中,表明成功誘導(dǎo)出了油菜毛狀根體系。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得的油菜毛狀根最佳誘導(dǎo)條件,用含有重組pRI101-gshB質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 11325侵染油菜子葉,誘導(dǎo)出了轉(zhuǎn)gshB基因的油菜毛狀根。PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根DNA基因組中含有960 bp左右的gshB基因片段,證明目的片段已經(jīng)整合到油菜核基因組中。采用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄油菜RNA獲得cDNA序列,PCR結(jié)果顯示cDNA序列中含有960 bp的目的片段,表明目的基因已經(jīng)在毛狀根中轉(zhuǎn)錄,說(shuō)明成功獲得了轉(zhuǎn)gshB基因的油菜毛狀根。毛狀根的Cd脅迫應(yīng)激響應(yīng)的初步實(shí)驗(yàn)表明,50 μmol/L的Cd對(duì)油菜野生型毛狀根和轉(zhuǎn)gshB毛狀根的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用；油菜野生型毛狀根和轉(zhuǎn)gshB毛狀根中SOD、POD酶的活性都有一定程度的升高,MDA的含量都增大,PI染色程度加深。同時(shí),在50 、μmol/L的Cd處理下,轉(zhuǎn)gshB毛狀根中SOD和POD酶活性的升高比例高于野生型毛狀根,MDA的量和PI染色程度都低于野生型毛狀根。這可能是由于轉(zhuǎn)入的gshB基因提高了油菜毛狀根螫合Cd的能力,減輕了毛狀根被Cd毒害的程度。轉(zhuǎn)gshB基因油菜毛狀根體系的建立,可為后續(xù)利用油菜毛狀根探究植物根系富集Cd的機(jī)制提供較好的實(shí)驗(yàn)研究體系。
【關(guān)鍵詞】：油菜 鎘重金屬超富集植物 正交試驗(yàn) 毛狀根 gshB
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 1 引言13-19
• 1.1 鎘污染環(huán)境修復(fù)現(xiàn)狀13-14
• 1.1.1 重金屬鎘的危害13
• 1.1.2 傳統(tǒng)方法在修復(fù)重金屬鎘污染環(huán)境中的應(yīng)用13
• 1.1.3 植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用13-14
• 1.2 植物組織細(xì)胞在修復(fù)環(huán)境污染研究中的應(yīng)用14
• 1.3 植物耐受重金屬鎘的機(jī)制14-16
• 1.3.1 植物螯合肽的螯合原理14-15
• 1.3.2 gshB基因富集重金屬鎘的分子機(jī)制15
• 1.3.3 膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)作用15-16
• 1.4 重金屬鎘超富集植物轉(zhuǎn)基因毛狀根改造研究16-17
• 1.5 油菜在修復(fù)鎘污染土壤中的研究17
• 1.6 課題研究目標(biāo)和意義17-19
• 1.6.1 課題研究目標(biāo)17
• 1.6.2 課題研究意義17-19
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法19-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 菌種和質(zhì)粒19
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與試劑盒19
• 2.1.4 培養(yǎng)基和試劑的配置19-20
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-30
• 2.2.1 菌株及其培養(yǎng)21
• 2.2.2 無(wú)菌苗的獲得21-22
• 2.2.3 毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)22
• 2.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)22-23
• 2.2.5 油菜毛狀根的PCR檢測(cè)23
• 2.2.6 構(gòu)建重組質(zhì)粒pRI101-gshB23-27
• 2.2.7 菌液PCR鑒定轉(zhuǎn)gshB發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC1132527
• 2.2.8 轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根的誘導(dǎo)27
• 2.2.9 轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根的PCR鑒定27-28
• 2.2.10 轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根的RT-PCR鑒定28
• 2.2.11 毛狀根生長(zhǎng)狀況的觀察和生物量的檢測(cè)28-29
• 2.2.12 SOD酶和POD酶活性的測(cè)定29
• 2.2.13 MDA含量的測(cè)定29
• 2.2.14 毛狀根的PI染色29-30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-43
• 3.1 油菜毛狀根誘導(dǎo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析30-32
• 3.1.1 不同菌株對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響31
• 3.1.2 不同外植體對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響31
• 3.1.3 不同侵染時(shí)間對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響31-32
• 3.1.4 不同外源激素對(duì)油菜毛狀根誘導(dǎo)的影響32
• 3.2 油菜毛狀根誘導(dǎo)的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析32-33
• 3.3 油菜毛狀根的鑒定33-34
• 3.4 連接產(chǎn)物pRI101-gshB重組質(zhì)粒雙酶切鑒定34-35
• 3.5 菌液PCR鑒定轉(zhuǎn)gshB發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC1132535
• 3.6 轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根的誘導(dǎo)和鑒定35-36
• 3.7 RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根36-37
• 3.8 Cd脅迫對(duì)毛狀根生長(zhǎng)和生物量的影響37-39
• 3.9 Cd脅迫對(duì)毛狀根SOD酶活性的影響39-40
• 3.10 Cd脅迫對(duì)毛狀根POD酶活性的影響40-41
• 3.11 Cd脅迫對(duì)毛狀根MDA含量的影響41-42
• 3.12 Cd脅迫下毛狀根的PI染色熒光顯微結(jié)果42-43
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論43-46
• 5 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 作者簡(jiǎn)歷及攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果49-51
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集51

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