目的:篩選出新塔花在不同組織(根、莖、葉、花)及脫落酸(ABA)處理不同時(shí)間的葉片中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。方法:從新塔花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜索到5個(gè)看家基因ZbIF3G1、ZbGAPDH1、ZbEF1γ、ZbUBC9、ZbTUBα,將其作為新塔花相對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR候選內(nèi)參基因,并設(shè)計(jì)內(nèi)參引物。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得5個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值,通過3種基于不同算法的軟件(GeNorm、NormFinder和BestKeeper)對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析。結(jié)果:ZbGAPDH1、ZbEF1γ的表達(dá)相對(duì)更為穩(wěn)定,適合作為新塔花不同組織及ABA處理的基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因,并用新塔花ZbFLS、ZbCHI基因的表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述預(yù)測(cè)。結(jié)論:確定ZbGAPDH1與ZbEF1γ為適合用于新塔花定量分析的內(nèi)參基因,該研究為新塔花后續(xù)相關(guān)基因表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1 新塔花總RNA的電泳檢測(cè)圖譜

以不同組織及ABA處理不同時(shí)間點(diǎn)的混合cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示,各內(nèi)參基因的長(zhǎng)度在100～250bp之間,均具有清晰單一的特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。分析實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物的熔解曲線,發(fā)現(xiàn)各內(nèi)參基因都只產(chǎn)生單一溶解峰,重復(fù)樣品間的曲線重合性較好....

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和溶解峰

圖1新塔花總RNA的電泳檢測(cè)圖譜2.3.2內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率:

圖3 候選內(nèi)參基因的Ct值范圍

GeNorm軟件根據(jù)輸入的Ct值得出平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M值,以此來確定穩(wěn)定的內(nèi)參基因。M值小于1.5,則基因相對(duì)穩(wěn)定。反之,則不穩(wěn)定。GeNorm分析結(jié)果表明,5個(gè)內(nèi)參基因的M值都小于1.5,表明5個(gè)內(nèi)參基因都比較穩(wěn)定。其中ZbGAPDH1、ZbEF1γ的M值最低,穩(wěn)定性較好;Zb....

圖4 GeNorm軟件分析5個(gè)內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)M

圖3候選內(nèi)參基因的Ct值范圍使用NormFinder軟件計(jì)算基因穩(wěn)定值M,M值越小,基因越穩(wěn)定。計(jì)算結(jié)果表明,ZbEF1γ的M值最低,也是所選內(nèi)參基因中最穩(wěn)定的。而ZbUBC9的M值最高,穩(wěn)定性最差。5個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性從高到低依次為ZbEF1γ>ZbGAPDH1>ZbTUBα>....

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