本研究將具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能的水稻黑條矮縮病毒（Rice black streaked dwarf virus,RBSDV）P7-2基因重組到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）的基因組中,以期為遺傳修飾桿狀病毒、提高殺蟲效果提供新思路。將帶有SV40終止子的AcMNPV多角體基因ph、AcMNPV ie-1啟動子、在C端融合Flag標(biāo)簽的P7-2基因依次插入到供體質(zhì)粒pFastBac-HTB的多克隆位點處,使用供體質(zhì)粒pFastBac-HTB自身的啟動子及ie-1啟動子分別啟動ph和P7-2基因的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)座的方法將ph、P7-2基因及啟動子插入到bacmid bMON14272的多角體位置,獲得重組bacmid Ac-P7-2,并通過Western blot檢測了P7-2基因的表達(dá)。在細(xì)胞水平上觀察了兩種病毒的多角體形成和統(tǒng)計了不同時間死亡細(xì)胞數(shù)量。通過病毒生長曲線和DNA復(fù)制曲線的測定,對比研究了兩種病毒的增殖和DNA復(fù)制差異。將重組病毒Ac-P7-2和野生型病毒Ac-...

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 桿狀病毒的概況
        1.1.1 桿狀病毒簡介
        1.1.2 桿狀病毒基因組的研究概況
        1.1.3 桿狀病毒的生物學(xué)
        1.1.4 桿狀病毒的生活史
        1.1.5 桿狀病毒在細(xì)胞中的增殖
    1.2 桿狀病毒的應(yīng)用
        1.2.1 用于外源基因的真核表達(dá)
        1.2.2 桿狀病毒用于基因治療
        1.2.3 桿狀病毒作為生物殺蟲劑
    1.3 重組桿狀病毒殺蟲劑的研究進(jìn)展
    1.4 研究設(shè)想
第二章 重組病毒Ac-P7-2的構(gòu)建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 載體、菌株及細(xì)胞系
        2.1.2 生化試劑及細(xì)胞培養(yǎng)基
        2.1.3 常規(guī)試劑的配制
        2.1.4 實驗所用引物
    2.2 方法
        2.2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.2.3 目的片段DNA分離回收
        2.2.4 連接反應(yīng)
        2.2.5 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        2.2.6 氯化鈣感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.7 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 堿裂解法提取質(zhì)粒
        2.2.9 目的基因的轉(zhuǎn)座
        2.2.10 BacmidDNA提取
        2.2.11 重組Bacmid的轉(zhuǎn)染
        2.2.12 蛋白免疫印跡雜交(Westernblot)
        2.2.13 供體質(zhì)粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的構(gòu)建
        2.2.14 重組BacmidAc-P7-2的構(gòu)建
        2.2.15 P7-2蛋白表達(dá)的鑒定
        2.2.16 實驗技術(shù)路線
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 供體質(zhì)粒HTB-phSV40-ie-1-FlagP7-2的構(gòu)建
        2.3.2 重組bacmidAc-P7-2的構(gòu)建
        2.3.3 P7-2蛋白表達(dá)的鑒定
    2.4 小結(jié)
第三章 Ac-P7-2的生物學(xué)特性研究
    3.1 實驗材料
    3.2 方法
        3.2.1 重組bacmidAc-P7-2轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞的光學(xué)顯微觀察與細(xì)胞死亡時間分析
        3.2.2 從感染病毒的細(xì)胞中提取病毒基因組
        3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品T-GP41的構(gòu)建
        3.2.4 病毒DNA復(fù)制曲線的測定
        3.2.5 病毒生長曲線的測定
        3.2.6 BV的大量制備
        3.2.7 多角體的擴(kuò)繁
        3.2.8 生物測定
        3.2.9 技術(shù)路線圖
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 Ac-P7-2轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞的光學(xué)顯微觀察及細(xì)胞死亡時間分析
        3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品T-GP41的構(gòu)建
        3.3.3 Ac-P7-2的復(fù)制曲線
        3.3.4 Ac-P7-2的生長曲線
        3.3.5 重組病毒LD50、LD90的測定
        3.3.6 重組病毒LT50、LT90的測定
    3.4 小結(jié)
第四章 結(jié)論
第五章 討論
參考文獻(xiàn)
附錄 本文所用溶液配方
縮略詞
致謝
作者簡介



本文編號：4016881