熊膽是一種傳統(tǒng)的珍稀藥材,是棕熊或黑熊的膽囊。熊去氧膽酸（UDCA）是熊膽的主要藥用成分,其與牛磺酸結合形成�；切苋パ跄懰幔═UDCA）,TUDCA被廣泛應用于各種肝膽疾病的治療。目前TUDCA主要是通過熊膽引流或化學合成的方法來獲取,但這兩種方法對生態(tài)和環(huán)境不友好。隨著生物技術和工程技術的融合發(fā)展,應用生物催化技術來大規(guī)模制備TUDCA將成為可能。本課題組前期發(fā)現(xiàn),在體外,可以以7α-HSDH為催化劑催化TCDCA發(fā)生7α-脫氫生成T7-KLCA,再進一步以7β-HSDH為催化劑催化T7-KLCA加氫而生成TUDCA。因此,7α-HSDH是體外應用生物催化技術制備TUDCA的關鍵酶之一。7α-HSDH的熱穩(wěn)定性和催化活性是決定其能否適應工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵因素。本文以獲取熱穩(wěn)定性好,催化活性高的7α-HSDH為目的,在黑熊腸道微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了一個新的7α-HSDH（命名為St-2-2）,系統(tǒng)的研究了St-2-2的酶學性質(zhì)。基于生物信息學分析,進一步對其羧基端進行了分子改造,獲得了熱穩(wěn)定性與活性都提高的突變體,并初步探討了突變體I255Q熱穩(wěn)定性提高的原因。本研究擴展了7α-HS...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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英文摘要
縮略表
1 緒論
    1.1 課題研究背景
    1.2 7α-HSDH研究現(xiàn)狀
    1.3 科學問題的提出及研究意義
    1.4 研究內(nèi)容
    1.5 技術路線
2 基于宏基因組數(shù)據(jù)挖掘新的7α-HSDH
    2.1 引言
    2.2 材料與儀器
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 實驗儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 7α-HSDH基因挖掘
        2.3.2 同源性及進化樹分析
        2.3.3 糞便樣品的采集
        2.3.4 黑熊糞便總DNA提取
        2.3.5 目的基因的克隆
        2.3.6 PCR產(chǎn)物鑒定與回收
        2.3.7 pGEX-6p-2-St-2-2 重組載體的構建
        2.3.8 St-2-2 的表達、純化
        2.3.9 粒徑排阻色譜分析蛋白分子量
        2.3.10 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜測定蛋白分子量
        2.3.11 St-2-2 的酶活測定
    2.4 結果與討論
        2.4.1 7α-HSDH基因挖掘、篩選與克隆
        2.4.2 7α-HSDH基因的重組載體構建及重組蛋白的表達純化
        2.4.3 同源性及進化樹分析結果
        2.4.4 粒徑排阻色譜分析、MALDI-TOF-MS質(zhì)譜測定蛋白分子量
        2.4.5 酶活檢測結果
    2.5 本章小結
3 St-2-2酶學性質(zhì)研究
    3.1 引言
    3.2 材料與儀器
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 St-2-2的表達與純化
        3.3.2 影響酶活的因素
        3.3.3 酶促動力學參數(shù)檢測
    3.4 結果與討論
        3.4.1 St-2-2 最適p H值
        3.4.2 St-2-2 最適溫度
        3.4.3 St-2-2 熱穩(wěn)定性研究
        3.4.4 金屬離子對St-2-2 酶活的影響
        3.4.5 酶促動力學參數(shù)檢測
    3.5 本章小結
4 St-2-2 的羧基端分子改造
    4.1 引言
    4.2 材料與儀器
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 突變引物的設計
        4.3.2 突變基因聚合酶鏈式反應
        4.3.3 PCR產(chǎn)物鑒定與回收純化
        4.3.4 突變載體的構建
        4.3.5 突變體表達
        4.3.6 突變體酶活力測定
        4.3.7 突變體熱穩(wěn)定性研究
        4.3.8 St-2-2 與突變體Tm值測定
        4.3.9 突變體I255Q與野生型St-2-2 的同源建模結構預測
        4.3.10 圓二色譜法測定St-2-2 和突變型I255Q二級結構
    4.4 結果與討論
        4.4.1 突變體基因突變位點信息
        4.4.2 突變體基因的克隆
        4.4.3 突變基因的重組載體構建及重組蛋白的表達純化
        4.4.4 突變體酶活檢測
        4.4.5 突變型St-2-2 的熱穩(wěn)定性研究
        4.4.6 野生型St-2-2 與突變型St-2-2的Tm值檢測
        4.4.7 野生型St-2-2 與突變體St-2-2 的同源建模結構預測
        4.4.8 野生型St-2-2 與突變型St-2-2 二級結構分析
    4.5 本章小結
5 全文總結及后續(xù)工作建議
    5.1 全文主要結論
    5.2 后續(xù)工作建議
參考文獻
附錄
    A.作者在攻讀學位期間發(fā)表的論文目錄
    B.作者在攻讀學位期間取得的科研成果目錄
    C.學位論文數(shù)據(jù)集
致謝



本文編號：4013250