大白菜（Brassica rapa L.ssp.Pekinensis）在農(nóng)作物領域中屬于常見的經(jīng)濟型農(nóng)產(chǎn)品,尤其在中國、日本和韓國等亞洲地區(qū)被大面積耕種。隨著基因工程技術的發(fā)展,農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化體系和基因編輯技術近年來不斷地應用于大白菜育種過程中,加快了大白菜育種進程,同時改良了大白菜性狀,為大白菜遺傳育種研究奠定了實驗基礎。本研究建立了穩(wěn)定高效的大白菜遺傳轉化體系,并將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地應用于大白菜基因編輯。（1）試驗材料選擇大白菜‘C-24’自交系,構建大白菜孤基因BraA1000785超表達載體,通過農(nóng)桿菌介導法,篩選農(nóng)桿菌感受態(tài)、農(nóng)桿菌菌液濃度、乙酰丁香酮濃度（AS）、外植體侵染時間和超聲輔助處理等影響因素。由此建立了大白菜遺傳轉化體系,轉化體系如下:農(nóng)桿菌感受態(tài):GV3101,菌液OD₆₀₀=0.5,侵染培養(yǎng)基（DM）添加AS濃度為20 mg·L^-1,外植體菌液侵染過程15 min且無需超聲處理,共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MC）添加AS濃度為20 mg·L^-1（共培養(yǎng)暗處理48h）,外植體在篩選培養(yǎng)基（M... 

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 植物基因工程技術
        1.1.1 植物基因工程技術的研究進展
        1.1.2 植物基因工程技術的應用
    1.2 蕓薹屬植物離體培養(yǎng)的研究
        1.2.1 蕓薹屬植物離體再生體系的研究進展
        1.2.2 蕓薹屬植物離體再生的影響因素
    1.3 農(nóng)桿菌介導蕓薹屬植物遺傳轉化的研究
        1.3.1 農(nóng)桿菌介導法的轉化機理
        1.3.2 影響農(nóng)桿菌介導蕓薹屬作物遺傳轉化的因素
    1.4 基因組編輯技術研究進展
        1.4.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與結構
        1.4.2 CRISPR/Cas9的作用機理
        1.4.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的應用
    1.5 本研究的主要內容
    1.6 本研究的目的及意義
第二章 大白菜遺傳轉化體系的建立
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 BraA1000785基因克隆
        2.1.3 BraA1000785超表達載體的構建
        2.1.4 大腸桿菌的制備
        2.1.5 農(nóng)桿菌的制備
        2.1.6 大白菜遺傳轉化體系的流程
        2.1.7 影響大白菜遺傳轉化的因素及統(tǒng)計分析
        2.1.8 大白菜轉基因植株的檢測方法
        2.1.9 大白菜遺傳轉化體系重復性試驗
    2.2 結果與分析
        2.2.1 BraA1000785基因序列分析
        2.2.2 BraA1000785超表達載體的構建
        2.2.3 農(nóng)桿菌陽性克隆鑒定
        2.2.4 農(nóng)桿菌菌株對大白菜遺傳轉化效率的影響
        2.2.5 農(nóng)桿菌菌液濃度對大白菜遺傳轉化效率的影響
        2.2.6 乙酰丁香酮濃度對大白菜遺傳轉化效率的影響
        2.2.7 外植體侵染時間對大白菜遺傳轉化效率的影響
        2.2.8 超聲輔助處理對大白菜遺傳轉化效率的影響
        2.2.9 大白菜轉基因植株的驗證
        2.2.10 大白菜遺傳轉化體系的穩(wěn)定性
    2.3 討論
        2.3.1 農(nóng)桿菌對遺傳轉化的影響
        2.3.2 酚類物質對遺傳轉化的影響
        2.3.3 超聲輔助處理對遺傳轉化的影響
        2.3.4 轉基因植株的檢測
    2.4 小結
第三章 大白菜CRISPR/Cas9基因編輯體系的建立
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 菌種及載體
        3.1.3 BraSca000221基因的生物信息學分析及獲得
        3.1.4 gRNA的設計
        3.1.5 CRISPR/Cas9載體的構建
        3.1.6 農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化
        3.1.7 轉基因植株的檢測
    3.2 結果與分析
        3.2.1 BraSca000221序列分析
        3.2.2 BraSca000221基因的靶點gRNA
        3.2.3 T0代轉基因植株的獲得
        3.2.4 CRISPR/Cas9編輯效果檢測
    3.3 討論
    3.4 小結
結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]結球甘藍自交系YL-1的高效遺傳轉化體系的建立及應用[J]. 崔慧琳,李志遠,方智遠,楊麗梅,莊木,呂紅豪,劉玉梅,宋江華,張揚勇.  園藝學報. 2019(02)
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[7]PEG介導的猴頭菌遺傳轉化體系的建立[J]. 劉莉,肖招燕,郭麗瓊,林俊芳,尤琳烽,廖靜文.  菌物學報. 2014(01)
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博士論文
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碩士論文
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[2]農(nóng)桿菌介導的大白菜遺傳轉化體系的建立[D]. 趙玉竹.沈陽農(nóng)業(yè)大學 2017
[3]大白菜遺傳轉化體系的優(yōu)化[D]. 趙靜.西北農(nóng)林科技大學 2016
[4]大白菜離體再生中LBD基因的作用和春化相關BrVIN3基因的遺傳轉化[D]. 李強.南京農(nóng)業(yè)大學 2015
[5]西蘭花再生體系的建立及遺傳轉化體系初探的研究[D]. 劉煜.東北農(nóng)業(yè)大學 2013
[6]大白菜真葉離體再生體系的研究[D]. 劉學成.西北農(nóng)林科技大學 2011
[7]大白菜BcDREB1基因的遺傳轉化研究[D]. 馬茜.河北農(nóng)業(yè)大學 2010



本文編號：3652521