本文關(guān)鍵詞：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)基因成分可視化檢測(cè)技術(shù)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一種快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),已被廣泛用于各領(lǐng)域。同時(shí),LAMP的高靈敏度也使擴(kuò)增產(chǎn)物開蓋檢測(cè)極易出現(xiàn)污染,而利用閉管檢測(cè)技術(shù)能有效降低污染機(jī)率。目前,LAMP結(jié)果檢測(cè)方法主要有電泳、濁度分析、熒光染料、LFD、微流控等,其中應(yīng)用較多的是電泳、濁度分析、HNB以及SYBR Green I指示劑�，F(xiàn)有方法存在需開蓋、材料昂貴、顏色變化均屬同一色系等不足,為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三項(xiàng)獨(dú)立的研究,主要研究成果如下:(1)LAMP-ACBK檢測(cè)系統(tǒng):本實(shí)驗(yàn)引入一種新型的金屬指示劑-酸性絡(luò)藍(lán)K(Acid Chrome Blue K,ACBK)建立了閉管LAMP結(jié)果可視化檢測(cè)技術(shù)。首先,我們?cè)贚AMP擴(kuò)增的起始體系中,分別測(cè)試了ACBK與緩沖液、dNTPs、引物、Mg2+等組分的反應(yīng),確定了含ACBK的LAMP體系其顏色變化由Mg2+決定,化學(xué)方法也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。隨后以花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CAMV35S,35S)為靶基因,建立了35S LAMP-ACBK檢測(cè)體系。該體系的檢測(cè)靈敏度針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)限為100拷貝,在分別含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因組中能檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因含量。同時(shí),利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同轉(zhuǎn)基因作物為材料驗(yàn)證了其檢測(cè)特異性,結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-ACBK檢測(cè)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的檢測(cè)特異性。最終,將該檢測(cè)體系成功用于對(duì)實(shí)際玉米樣品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果既可以裸眼直接判斷也可以借助紫外可見光譜分析。(2)LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng):以G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的綠色為基礎(chǔ)建立了LAMP擴(kuò)增和結(jié)果可視化檢測(cè)技術(shù)。首先,在LAMP擴(kuò)增體系中分別加入(FIP/BIP,FLP/BLP),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP),(FIP/BIP,FLP/BLP-G4),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP-G4)四組引物組合,在63°C(12,24,36,48,60)min,85°C 2 min擴(kuò)增條件下擴(kuò)增,確定了(FIP/BIP,FLP/BLP-G4)為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增引物。隨后以含35S的轉(zhuǎn)基因材料模板,建立了35S LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng),且該系統(tǒng)針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)限為32 ng/μL。同時(shí),利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同作物的轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證了其檢測(cè)特異性,結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的檢測(cè)特異性。(3)LAMP-試紙條檢測(cè)系統(tǒng):本研究旨在建立一種基于試紙條的35S或TNOS的LAMP擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)方法,該方法在LAMP擴(kuò)增結(jié)束后2-3 min內(nèi)即可用肉眼判讀結(jié)果。首先對(duì)修飾后的LAMP引物做了可用性檢測(cè),隨后,對(duì)試紙條的特異性及靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,評(píng)價(jià)所用的5種陽(yáng)性樣品均出現(xiàn)質(zhì)控線與檢測(cè)線,電泳呈特異的梯狀條帶,與普通PCR結(jié)果一致。表明該試紙條可用于35S及TNOS LAMP擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè),且有較高的特異性,兩種試紙條的靈敏度分別為5.4 ng/μL、27.2 ng/μL。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP) 酸性絡(luò)藍(lán)K(ACBK) G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶 試紙條 可視化
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 引言9-18
• 1.1 國(guó)內(nèi)外研究概況9-12
• 1.1.1 電泳10
• 1.1.2 熒光染料法10-11
• 1.1.3 基于鎂離子、焦磷酸根的檢測(cè)技術(shù)11-12
• 1.1.4 與其他技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)12
• 1.2 本論文研究目的、意義與主要研究?jī)?nèi)容12-14
• 1.2.1 研究目的和意義12-13
• 1.2.2 主要研究?jī)?nèi)容13-14
• 1.3 實(shí)驗(yàn)原理14-18
• 1.3.1 LAMP-ACBK檢測(cè)系統(tǒng)14-16
• 1.3.2 LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)16
• 1.3.3 LAMP-試紙條檢測(cè)系統(tǒng)16-18
• 第二章 ACBK可視化檢測(cè)LAMP擴(kuò)增結(jié)果18-27
• 2.1 材料和方法18-20
• 2.1.1 材料18-19
• 2.1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料18
• 2.1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑18
• 2.1.1.3 主要儀器設(shè)備18
• 2.1.1.4 引物18-19
• 2.1.2 方法19-20
• 2.1.2.1 DNA提取19
• 2.1.2.2 DNA擴(kuò)增19
• 2.1.2.3 擴(kuò)增結(jié)果分析19
• 2.1.2.4 ACBK在LAMP體系中的可行性分析與濃度篩選19-20
• 2.1.2.5 LAMP-ACBK體系優(yōu)化20
• 2.1.2.6 LAMP-ACBK特異性與靈敏度實(shí)驗(yàn)20
• 2.1.2.7 LAMP-ACBK對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)20
• 2.2 結(jié)果與分析20-25
• 2.2.1 ACBK指示劑在LAMP體系中的可行性分析20-21
• 2.2.2 LAMP擴(kuò)增體系確定21-22
• 2.2.3 特異性22-23
• 2.2.4 靈敏度23-24
• 2.2.5 對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)24-25
• 2.3 討論25-27
• 第三章 G四聯(lián)體可視化檢測(cè)LAMP擴(kuò)增結(jié)果27-34
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 3.1.2 試劑27
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備27
• 3.1.4 引物27-28
• 3.2 方法28-29
• 3.2.1 DNA提取28
• 3.2.2 DNA擴(kuò)增28
• 3.2.3 G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)28
• 3.2.4 hemin指示濃度及檢測(cè)液加樣量篩選28-29
• 3.2.5 特異性與靈敏度實(shí)驗(yàn)29
• 3.3 結(jié)果與分析29-32
• 3.3.1 引物G4序列對(duì)LAMP擴(kuò)增影響29-30
• 3.3.2 hemin指示濃度及檢測(cè)液加樣量篩選30-31
• 3.3.3 特異性31
• 3.3.4 靈敏度31-32
• 3.4 討論32-34
• 第四章 試紙條可視化檢測(cè)LAMP擴(kuò)增結(jié)果34-39
• 4.1 材料和方法34-35
• 4.1.1 材料34-35
• 4.1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 4.1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑34
• 4.1.1.3 主要儀器設(shè)備34
• 4.1.1.4 引物34-35
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法35
• 4.1.2.1 DNA提取35
• 4.1.2.2 DNA擴(kuò)增35
• 4.1.2.3 試紙條檢測(cè)LAMP擴(kuò)增結(jié)果35
• 4.1.2.4 特異性與靈敏度實(shí)驗(yàn)35
• 4.2 結(jié)果與分析35-37
• 4.2.1 特異性35-36
• 4.2.2 靈敏度36-37
• 4.3 討論37-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷44-45
• 致謝45

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本文編號(hào)：264540