本文關鍵詞：甘藍枯萎病抗性基因FOC1相關SNP與互作蛋白的篩選與初步分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在已成功克隆甘藍枯萎病抗性基因FOC1的基礎上,本研究篩選了FOC1相關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點,并對SNP基因序列以及氨基酸序列進行了一定程度的分析,發(fā)掘了與甘藍枯萎病抗性基因FOC1相關的特異性SNP,為進一步開發(fā)FOC1特異分子標記提供理論依據。與此同時,本研究構建了酵母誘餌菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1],利用酵母雙雜交技術驗證了其自激活及毒性作用,從而在甘藍均一化cDNA文庫中篩選到與甘藍枯萎病基因FOC1表達蛋白互作的獵物蛋白,研究結論如下:1.本試驗在對11份甘藍自交系材料枯萎病抗病表型鑒定基礎上,通過基因測序對每份材料中的FOC1等位基因及相應的氨基酸序列變異進行分析。結果表明,FOC1等位基因序列之間共存在92處SNP變異和2處Indel變異,其中包含C381A/G等18個在抗、感材料中表現(xiàn)出特異性差異的SNPs。此18個特異的SNP中轉換型比率為86.11%、顛換型比率為13.89%,4種堿基變異率以T/C、G/A最高,分別占47.22%和38.89%,C/G和A/C變異率共占13.89%。同時,抗、感材料中共有23處氨基酸變異,在5份抗病材料中,除P10外的其余自交系均有一個氨基酸變異(H34D),該變異未造成氨基酸的親/疏水性變化,可能不影響該基因的功能。另外,本研究也發(fā)現(xiàn)抗、感材料中存在4個特異的SNP,可造成3個氨基酸的變化。2.建立在已成功克隆甘藍枯萎病抗性基因FOC1的基礎上,利用酵母雙雜交技術構建了誘餌質粒載體pGBKT7-FOC1,并成功轉入酵母菌株Y2HGold,形成了酵母誘餌菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1],同時進行自激活及毒性檢測。經試驗可知融合蛋白本身不具有激活ADE2等報告基因的能力,即pGBKT7-FOC1在酵母中無自激活作用。誘餌酵母菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1]菌液的OD600值與空白對照Y2HGold[pGBKT7]的OD600兩者相差不大并且均大于0.8,說明誘餌載體pGBKT7-FOC1對宿主細胞無自毒作用。試驗證明基因FOC1不會對酵母Y2HGold菌株的生長產生較大的影響,酵母菌可以正常生長,可用于甘藍均一化cDNA文庫的篩選。3.根據酵母雙雜交系統(tǒng)技術,利用上述所得的酵母誘餌菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1]篩選甘藍均一化cDNA文庫,最終試驗結果顯示,經過初步篩選和回轉驗證證明,與甘藍枯萎病抗性基因FOC1表達蛋白互作的蛋白的基因分別為FOC1 A、FOC1 B、FOC1 C以及FOC1 D。將其序列提交至NCBI、BRAD和TAIR數據庫中進行同源性比對,獲得有匹配結果的候選蛋白,并發(fā)現(xiàn)FOC1 D基因的注釋為磷酸核酮糖激酶,它可能存在與甘藍枯萎病抗逆性相關的作用,這為將來研究甘藍抗枯萎病育種這一重要性狀提供相關的線索,為我們接下來的研究工作做了充分的準備。
【關鍵詞】：甘藍枯萎病 FOC1 SNP 酵母雙雜交 互作蛋白
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.5
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-5
• 縮略詞表5-9
• 第一章 文獻綜述9-18
• 1.1 甘藍的概述及價值9-10
• 1.1.1 甘藍類作物及其栽培變種9
• 1.1.2 甘藍的價值9-10
• 1.2 甘藍枯萎病概述及特征10-12
• 1.2.1 甘藍枯萎病的概述10
• 1.2.2 甘藍枯萎病發(fā)生和發(fā)展10-11
• 1.2.3 甘藍枯萎病致病菌概述11
• 1.2.4 甘藍枯萎病的綜合防治11-12
• 1.3 SNP的概述及應用12-13
• 1.3.1 SNP的概述12
• 1.3.2 SNP的應用12-13
• 1.4 酵母雙雜交技術簡介13-15
• 1.4.1 酵母雙雜交技術的原理13-14
• 1.4.2 酵母雙雜交技術應用14-15
• 1.5 研究意義15-18
• 1.5.1 研究基礎15-16
• 1.5.2 研究目的16-18
• 第二章 甘藍枯萎病抗性基因FOC1相關SNP的篩選18-30
• 2.1 材料18
• 2.1.1 試驗材料18
• 2.1.2 菌種來源及孢子懸浮液18
• 2.2 方法18-19
• 2.2.1 枯萎病接種方法18-19
• 2.2.2 病情調查19
• 2.2.3 DNA提取及引物設計19
• 2.2.4 PCR擴增及測序19
• 2.2.5 基因序列分析19
• 2.3 結果與分析19-28
• 2.3.1 11份甘藍材料抗枯萎病表型及分子鑒定19-20
• 2.3.2 11份甘藍材料中FOC1等位基因的序列分析20-25
• 2.3.3 抗、感材料中FOC1等位基因特異變異分析25-26
• 2.3.4 抗、感材料中FOC1等位基因的氨基酸序列變異分析26-28
• 2.4 小結與討論28-30
• 第三章 酵母誘餌菌株的構建30-40
• 3.1 材料30-31
• 3.1.1 試驗材料30-31
• 3.1.2 酶及主要試劑31
• 3.1.3 主要儀器設備31
• 3.2 方法31-35
• 3.2.1 誘餌質粒載體pGBKT7-FOC1的構建與鑒定31-33
• 3.2.2 誘餌酵母菌株Y2Hgold [pGBKT7-FOC1]制備33-34
• 3.2.3 誘餌質粒pGBKT7-FOC1自激活檢測34
• 3.2.4 誘餌質粒pGBKT7-FOC1毒性檢測34-35
• 3.3 結果與分析35-38
• 3.3.1 誘餌載體pGBKT7-FOC1重組質粒的構建和分析35
• 3.3.2 酵母菌株Y2HGold表型鑒定35-36
• 3.3.3 pGBKT7-FOC1轉化酵母菌Y2HGold36-37
• 3.3.4 誘餌質粒pGBKT7-FOC1的自激活檢測37-38
• 3.3.5 誘餌質粒pGBKT7-FOC1毒性檢測38
• 3.4 小結與討論38-40
• 第四章 甘藍抗枯萎病基因FOC1互作蛋白的篩選40-49
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 酵母誘餌菌株與甘藍cDNA文庫40
• 4.1.2 主要試劑40-41
• 4.1.3 主要儀器設備41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 Mating法篩選與FOC1基因表達蛋白的互作蛋白41-42
• 4.2.2 初步篩選候選克隆42
• 4.2.3 菌落驗證42-43
• 4.2.4 獲得陽性候選獵物質粒43
• 4.2.5 陽性候選獵物質�；剞D驗證43
• 4.2.6 陽性候選基因測序及分析43
• 4.3 結果與分析43-47
• 4.3.1 雜交觀察43-44
• 4.3.2 陽性候選克隆的篩選和鑒定44-45
• 4.3.3 獲得單一文庫質粒45-46
• 4.3.4 單一文庫質粒回轉驗證46
• 4.3.5 互作蛋白相關基因生物信息學分析46-47
• 4.4 小結與討論47-49
• 第五章 結論49-50
• 參考文獻50-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57-58
• 導師簡介58-60

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 張靜;梁衛(wèi)紅;;2種非生物脅迫和7種激素對水稻OsAQP基因表達的影響[J];河南師范大學學報(自然科學版);2016年01期

2 鄭鵬茜;劉立根;;骨髓增生異常綜合征伴獲得性α地中海貧血中X連鎖α地中海貧血伴智力障礙基因突變的研究進展[J];國際輸血及血液學雜志;2015年05期

3 謝光蓉;趙百學;王e

本文編號：264374