【摘要】：酰胺的合成不僅為植物儲(chǔ)存了氮素而且能消除因氨濃度過(guò)高而產(chǎn)生的毒害作用。氨毒的表現(xiàn)是使光合磷酸化解偶聯(lián),影響ATP的形成,因此對(duì)酰胺代謝相關(guān)基因的研究具有重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal Gene Transfer,HGT),是指在沒(méi)有生殖關(guān)系的不同物種之間遺傳物質(zhì)的交流過(guò)程。水平基因轉(zhuǎn)移是生物體除垂直遺傳外另一種獲得遺傳信息的方式。水平基因轉(zhuǎn)移事件的發(fā)生增加了生物體的遺傳變異,引起生物體功能的改進(jìn)和革新,增強(qiáng)了生物體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。已有研究表明,陸生植物中的酰胺酶家族在進(jìn)化上起源于水平基因轉(zhuǎn)移事件,并以細(xì)菌為供體。為對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究,本實(shí)驗(yàn)以陸生植物中酰胺酶家族成員水稻OsAMI10基因作為研究對(duì)象,利用生物信息學(xué)和反向遺傳學(xué)的方法,對(duì)該基因的起源和功能進(jìn)行了初步的探討：1.以水稻OsAMI10基因作為檢索序列,對(duì)NCBI的nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、Phytozome植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等檢索發(fā)現(xiàn),除裸子植物挪威云杉(Piceaabies)外,其余目前已經(jīng)完成測(cè)序的陸生植物中均具與OsAMI10高度同源的基因,并且也沒(méi)有在裸子植物基因組中發(fā)現(xiàn)編碼AMI10蛋白質(zhì)的基因。對(duì)綠色植物代表性物種基因組的進(jìn)化分析顯示,小立碗蘚、番茄、雷蒙德氏棉的AMI1O同源基因均是在其他物種分化之后通過(guò)基因復(fù)制的方式產(chǎn)生的。二穗短柄草的2個(gè)同源基因是通過(guò)串聯(lián)重復(fù)形成的一對(duì)同源基因。通過(guò)對(duì)內(nèi)含子相位和位置的比較發(fā)現(xiàn),盡管存在內(nèi)含子丟失和獲取等進(jìn)化機(jī)制,但植物AMI1O基因的內(nèi)含子位置在大部分物種中是保守的。2.對(duì)在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的AMI1O高度同源的基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠色植物的AMI10基因是單次起源的。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將AMI1O高度同源的基因劃分為2個(gè)同源基因簇(A和B),植物的AMI1O基因是同源基因簇A中的細(xì)菌物種水平轉(zhuǎn)移至植物中的結(jié)果,起源的時(shí)間可能是在輪藻與chlorophyta類綠藻分化之前。3.利用一對(duì)基因組引物L(fēng)P和RP以及一個(gè)T-DNA邊界引物BP進(jìn)行純合突變體鑒定,然后對(duì)鑒定為純合突變體的植株進(jìn)行OsAMI10基因表達(dá)水平分析,結(jié)果表明,osami10純合突變體OsAMI10基因的表達(dá)量相比于野生型變化并不明顯,這可能是由于T-DNA插入在內(nèi)含子上從而導(dǎo)致OsAMI10基因表達(dá)變化不明顯。4.過(guò)表達(dá)和RNAi植株與野生型植株在表型上存在明顯差異。在水稻生長(zhǎng)的全生育期分別測(cè)量野生型、過(guò)表達(dá)和RNAi植株的農(nóng)藝性狀,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)植株的株高顯著高于野生型,百粒重則低于野生型；RNAi植株的分蘗、穗數(shù)和百粒重則顯著低于野生型。5.水稻OsAMI10基因可能與葉綠素合成有關(guān)。在水稻生長(zhǎng)至四葉期測(cè)量野生型和RNAi植株的葉綠素含量,結(jié)果表明,RNAi植株的葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總量都極顯著地低于野生型。對(duì)OsAMI10基因進(jìn)行干擾沉默會(huì)影響植株葉綠素的合成,由此推測(cè)OsAMI10基因可能與葉綠素合成有關(guān)。6.水稻OsAMI10基因的表達(dá)受氮素的調(diào)控。為明確氮素對(duì)水稻OsAMI10基因表達(dá)的影響,對(duì)Dongjin四葉期幼苗進(jìn)行缺氮脅迫。結(jié)果顯示,OsAMI10基因表達(dá)受缺氮處理的抑制,在缺氮培養(yǎng)6h時(shí)達(dá)到最低值,在6h后略有上升并趨于穩(wěn)定,并在恢復(fù)供氮1d后表達(dá)量基本恢復(fù)處理之前的水平。7.水稻OsAMI10基因編碼的蛋白具有酰胺酶活性。OsAMI10蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白屬于酰胺酶家族,可能具有酰胺酶活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果,于水稻四葉期測(cè)定野生型、過(guò)表達(dá)和RNAi植株葉片谷氨酰胺酶的活性,結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)植株和RNAi植株與野生型植株之間的差異均達(dá)到了極顯著水平,這表明水稻OsAMI10基因編碼的蛋白具有酰胺酶活性,與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的結(jié)果相吻合。
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為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。逡逑１．２憸胺酶的研究進(jìn)展逡逑憸胺酶是廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中的一類水解酶（圖１．１）邋口４］，它能夠催化憸逡逑胺水解生成相應(yīng)的}舅岷桶保簦鰨欏：ò訪缸畛醣蝗銜橇虼濟(jì)�，，ＫｅP猓幔幔螅瑁椋郟擔(dān)叮菡業(yè)攪藨湴訪傅膩義匣钚暈壞�，进而证明了憸霸L贛胩於彼岬鞍酌鋼淶慕叵�。人们对酌霸L訃易宓難繡義暇考河瀉艸な奔洌云浞從砟殼安⒉皇嗆芮宄�。辶x咸镥義賢翓卞義蟍xuvｒ逡逑ｒＵｎｔｓ邐一＾逡逑ｉｋｉｅＡｉｅＷ＊＊－逡逑圖１．１憸胺酶在自然界中的分布逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｎａｔｕｒａｌ邋ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ａｍｉｄａｓｅｓ邋ｉｎ邋ｎａｔｕｒｅ［５４］逡逑１．２．１焌胺酶的分類逡逑憸胺酶在自然界中存在廣泛。早期研究人員將憸胺酶主要分為兩大類：廣譜憸胺酶和逡逑立體異構(gòu)選擇性憸胺酶。目前憸胺酶常見(jiàn)的分類方式有很多種，這些分類主要是基于憸胺逡逑酶催化活性、進(jìn)化關(guān)系、氨基酸序列等Ｐ７－Ｗ。根據(jù)催化活性將憸胺酶分為：Ｄ－氨r爛�、（Ｘ－辶x習(xí)被鶓湴訪�、脂肪酸憸霸L浮⑹中詰湴訪�、芳祥犲繊乖L負(fù)凸閆讘湴訪福ㄍ跡保玻╁澹簦鰲８蒎義習(xí)被嶁蛄鋅桑保薹治粲趹湴訪感藕偶易宓膽湴訪負(fù)橢咀鍛湴訪�。根据催化的立体选择辶x閑緣牟煌煞治櫻蛻湴訪負(fù)停遙蛻湴訪浮ｅ義

本文編號(hào)：2576621