【摘要】：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵限速酶�；谝褱y(cè)序的條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型基因組序列,利用RT-PCR方法克隆了該病菌葡萄糖-6-磷酸脫氫酶PsG6PDH1的全長(zhǎng)cDNA序列(1 497bp),編碼498個(gè)氨基酸的蛋白。編碼蛋白含有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的保守功能域。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),PsG6PDH1與禾柄銹菌小麥專(zhuān)化型的G6PDH聚為一簇。qRT-PCR分析表明,PsG6PDH1在病菌侵染早期的表達(dá)明顯上調(diào),其中侵染24h時(shí)表達(dá)量最高,為對(duì)照夏孢子的30倍。將PsG6PDH1導(dǎo)入釀酒酵母G6PDH缺失突變體中成功表達(dá),并表現(xiàn)出較強(qiáng)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性,明顯酵母增強(qiáng)了菌株對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性。由此推測(cè),PsG6PDH1可能參與了條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型在侵染寄主時(shí)抵御寄主的氧化脅迫反應(yīng)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該病菌基礎(chǔ)代謝及侵染機(jī)理奠定一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

王秋玲等/條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型葡萄糖 6 磷酸脫氫酶基因PsG6PDH1的表達(dá)特征及功能分析菌物學(xué)報(bào)1203果進(jìn)行分析獲得PsG6PDH1基因序列，，經(jīng)ORFFinder預(yù)測(cè)，該基因含有1497bp的ORF。提取病菌CYR32萌發(fā)的夏孢子的RNA，合成cDNA第一鏈為模板，利用引物G6PDH F/G6PDH R進(jìn)行RT PCR擴(kuò)增，回收目標(biāo)片段，并克壟測(cè)序（圖1），測(cè)序結(jié)果與基因組公布序列一致。圖1條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型PsG6PDH1cDNA的擴(kuò)增及克隆驗(yàn)證A：RT PCR擴(kuò)增PsG6PDH1cDNA；B：重組質(zhì)粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的雙酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鑒定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam軟件預(yù)測(cè)PsG6PDH1基因編碼498個(gè)氨基酸，分子量大小為56.59kDa，等電點(diǎn)為8.54。利用Pfam對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白中含有葡萄糖六磷酸脫氫酶保守功能域（圖2A），一個(gè)NAD（P）結(jié)合域（第15 205位氨基酸），一個(gè)葡萄糖六磷酸脫氫酶激活位點(diǎn)（192 198位氨基酸）。為進(jìn)一步明確PsG6PDH1與其他真菌G6PDH蛋白的進(jìn)化關(guān)系，從BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并選擇了12個(gè)來(lái)自擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示，PsG6PDH1與禾柄銹菌小麥專(zhuān)化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性達(dá)到95%；與青楊葉銹菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性達(dá)到86%，但與釀酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性?xún)H為54%。通過(guò)MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2B），結(jié)果表明，PsG

隆驗(yàn)證A：RT PCR擴(kuò)增PsG6PDH1cDNA；B：重組質(zhì)粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的雙酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鑒定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam軟件預(yù)測(cè)PsG6PDH1基因編碼498個(gè)氨基酸，分子量大小為56.59kDa，等電點(diǎn)為8.54。利用Pfam對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白中含有葡萄糖六磷酸脫氫酶保守功能域（圖2A），一個(gè)NAD（P）結(jié)合域（第15 205位氨基酸），一個(gè)葡萄糖六磷酸脫氫酶激活位點(diǎn)（192 198位氨基酸）。為進(jìn)一步明確PsG6PDH1與其他真菌G6PDH蛋白的進(jìn)化關(guān)系，從BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并選擇了12個(gè)來(lái)自擔(dān)子菌門(mén)和子囊菌門(mén)真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示，PsG6PDH1與禾柄銹菌小麥專(zhuān)化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性達(dá)到95%；與青楊葉銹菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性達(dá)到86%，但與釀酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性?xún)H為54%。通過(guò)MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2B），結(jié)果表明，PsG6PDH1與擔(dān)子菌門(mén)的禾柄銹菌小麥專(zhuān)化型P.graminisf.sp.tritici、青楊葉銹菌Melampsoralarici populina、玉米瘤黑粉Ustilagomaydis、裂褶菌Schizophyllumcommune的G6PDH蛋白聚為一類(lèi)；而子囊菌門(mén)真菌的G6PDH聚為一類(lèi)，表明PsG6PDH1與來(lái)自擔(dān)子菌門(mén)的真菌的G6PDH圖2條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型PsG6PDH1結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析A：條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型PsG6PDH1蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；B：條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型PsG6PDH1與其他真

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