發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 09:35

【摘要】：池塘養(yǎng)殖是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要方式,但在養(yǎng)殖過(guò)程中由于大量使用配合飼料造成了池塘中氮素的大量富集。養(yǎng)殖池塘中氮的去除主要依賴于微生物主導(dǎo)的硝化/反硝化過(guò)程,其中氨氧化微生物(AOB-氨氧化細(xì)菌和AOA-氨氧化古菌:AOB-ammonia oxidizing bacteria,AOA-ammonia oxidizing archaea)參與的氨氧化過(guò)程是其限速步驟。本文在優(yōu)化氨氧化微生物氨單加氧化物酶(amoA)基因擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上,對(duì)江漢平原5個(gè)典型養(yǎng)殖池塘(標(biāo)記為B1、B2、B3、B4、B5)水體和沉積物不同分層中的氨氧化微生物進(jìn)行了研究,并結(jié)合水質(zhì)和沉積物性質(zhì)分析,研究了氨氧化微生物在養(yǎng)殖池塘中的垂直分布特征及影響因素,以期為養(yǎng)殖池塘中氮素的調(diào)控提供理論依據(jù)。本文主要的研究結(jié)果如下:1.利用控制變量法,針對(duì)PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)的雜帶、拖帶及非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題,在不同的模板濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)以及是否添加腐殖酸抑制劑條件下探索了PCR擴(kuò)增的最佳條件。結(jié)果顯示在退火溫度設(shè)置為58℃、循環(huán)次數(shù)為32時(shí)有利于PCR擴(kuò)增。當(dāng)擴(kuò)增含有腐殖酸較多的模板時(shí),加入一定量的BSA可以提高Taq酶的活性,并有助于提高擴(kuò)增效率。2.在養(yǎng)殖池塘中,水柱中僅檢測(cè)出AOA,而未檢測(cè)到AOB,而在沉積物中可以同時(shí)檢測(cè)出AOA和AOB,養(yǎng)殖池塘水柱中AOA是主要的氨氧化微生物。在克隆測(cè)序中,所挑取的克隆數(shù)的基因覆蓋率達(dá)90%以上,檢測(cè)出的OTU序列均不多,但是AOB amoA基因和AOA amoA基因的豐度較高,多樣性指數(shù)比較低。在97%相似度的水平上,水柱中檢測(cè)到的AOA amoA基因的OTU有14個(gè),沉積物中AOA amoA基因的OTU有18個(gè),沉積物中AOB amoA基因的OTU序列有15個(gè)。在養(yǎng)殖池塘中,水柱中的OTU數(shù)目少于沉積物中的OTU,但水柱中和沉積物中的AOA amoA基因OTU序列均隸屬于Nitrososphaera cluster、Nitrosopumilus cluster和Nitrososphaera sister group,但是水柱中的OTU序列主要屬于Nitrososphaera cluster,而沉積物中的大多數(shù)OTU序列屬于Nitrososphaera sister group。沉積物AOB amoA基因OTU序列均勻分布在β亞綱的Nitrosomonas和Nitrosospira,不存在γ亞綱Nitrosococcus種群。氨氧化微生物的豐度和多樣性結(jié)果顯示,AOB amoA基因和AOA amoA基因的豐度較高,多樣性指數(shù)比較低。水質(zhì)和沉積物的性質(zhì)對(duì)氨氧化微生物的影響分析結(jié)果顯示,水質(zhì)與水柱中AOA amoA基因的豐富和多樣性并未存在顯著相關(guān)性,同時(shí)水質(zhì)和沉積物中的AOB amoA基因的豐度和多樣性也不存在顯著的相關(guān)性,但是水體的pH和溶解氧與沉積物中的AOB amoA基因的Shannon-Wiener指數(shù)呈顯著的正相關(guān),而氨氮的濃度與沉積物中的AOB amoA基因的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。沉積物的pH和微生物量碳(MBC)對(duì)沉積物中的AOA amoA基因的豐度有一定的影響,pH和Simpson指數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān),MBC與Shannon-Wiener指數(shù)呈顯著性的正相關(guān)。沉積物中硝氮濃度與水體的AOA amoA基因的豐度呈顯著性負(fù)相關(guān),氨氧化速率與水柱中AOA amoA基因的豐度呈顯著性的正相關(guān),酸性磷酸酶活性與水柱中AOA amoA基因的Simpson指數(shù)呈顯著的正相關(guān)。3.沉積物的不同分層的8個(gè)樣品中,7個(gè)樣品中可以挑出較多的AOA amoA基因的克隆子進(jìn)行分析,聚類分析顯示,底層沉積物的AOA amoA基因更為相似,而表層和中層的AOA amoA基因更相似,在97%相似度的水平上,AOA amoA基因的OTU序列有22個(gè),在B4和B5池塘沉積物中,表層和中層的優(yōu)勢(shì)種群一致,而底層的優(yōu)勢(shì)種群相同;AOA種群較未分層更為豐富,Nitrosotalea cluster僅存在分層沉積物中。僅有5個(gè)樣品可以挑出較多的AOB amoA基因的克隆子進(jìn)行分析,聚類分析顯示,除表層沉積物的AOB amoA基因更為相似外,整體上看B4和B5沉積物的AOB amoA基因存在較大差異;在97%相似度的水平上,AOB amoA基因的OTU序列有12個(gè),AOB amoA基因的優(yōu)勢(shì)種群是Otu 01,占總克隆數(shù)的70.8%,除B1b的優(yōu)勢(shì)種群是Otu 02外,B1s的優(yōu)勢(shì)種群不突出,其他各點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)種群均是Otu 01。AOB分類與未分層的一致,但是分層中Nitrosospira為優(yōu)勢(shì)種群。相關(guān)性分析顯示沉氨氮的濃度與AOA amoA基因的豐度呈顯著的負(fù)相關(guān)(P0.05),酸性磷酸酶的活性與AOA amoA基因的Shannon-Wiener指數(shù)呈極顯著的負(fù)相關(guān),與Simpson指數(shù)呈顯著的正相關(guān)。β-葡萄糖苷的活性與AOB amoA基因的Simpson指數(shù)呈顯著的負(fù)相關(guān),亞硝氮的濃度與與AOB amoA基因Simpson指數(shù)呈極顯著的負(fù)相關(guān)。
【圖文】：

中的存在形態(tài)主要有：惰性的 N2、最低氧化態(tài)的氨(包括 NH3、NH+4、R-N高氧化態(tài)的 NO-3。不同形態(tài)的氮可以通過(guò)固氮作用、氨化作用、硝化作用化作用等相互轉(zhuǎn)化，并與各系統(tǒng)中的氮相互交換，以此構(gòu)成了復(fù)雜的氮循（圖 1-1）[1,2]，而驅(qū)動(dòng)氮循環(huán)主要是微生物。隨著農(nóng)業(yè)尤其是養(yǎng)殖業(yè)的快速污染已經(jīng)成為亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。而氮的去除主要是由微生物通過(guò)硝化

以長(zhǎng)江流域的樣品 C1 為例，將沉積物 DNA 分別稀釋 2 倍、5 倍、10 倍、2倍、50 倍和 100 倍，反應(yīng)體系 25μl：包括 12.5μl DreamTaq Green MasterMix (2x)10μM amoA-1F/amoA-2R 各 1μl，，1μl 模板 DNA，補(bǔ) ddH2O 至 25μl。擴(kuò)增條件：95℃30s；40cycles（95℃，5s；54℃，40s；72℃，70s）；80℃，20s。并設(shè)置一組陰性對(duì)照，其電泳圖如圖 2-1 所示。由圖可見(jiàn)，模板 DNA 不經(jīng)稀釋，PCR 擴(kuò)增效率
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X172;X714

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 岳冬梅;田夢(mèng);宋煒;肖琳;楊柳燕;;太湖沉積物中氮循環(huán)菌的微生態(tài)[J];微生物學(xué)通報(bào);2011年04期

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本文編號(hào)：2614846